[发明专利]一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法

摘要

本发明公开了一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，该方法包括以下步骤：将iPS细胞消化后吹吸分散成单个细胞悬液，分种在培养孔中，每孔加入ROCK抑制剂；分种后的第一天，吸弃上清液，加入神经诱导完全培养基，培养直至获得P1代的神经干细胞；将P1代的神经干细胞接种到神经元诱导培养基中培养，培养基中要添加雷帕霉素以促进自噬的发生；2天后，将培养基更换为添加低浓度的雷帕霉素以促进自噬的神经元细胞分化培养基，培养至12‑15天可诱导分化为神经元细胞。本发明方法可加快神经元的诱导分化形成，并且改善了脊髓小脑共济失调三型iPS的神经元生长状态。

主权项

1.一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)融合度70‑80％的人诱导多能干细胞，加入预热的细胞消化液后37℃孵育5分钟，接着用移液管吹吸若干次，使细胞分散成单个细胞悬液，然后将细胞分种在培养孔中；每孔加入ROCK抑制剂后放入37℃、5％CO2的培养箱中培养；(2)分种后的第一天，吸弃培养孔的上清液以除去未贴壁的细胞，加入预热的神经诱导完全培养基，置于培养箱中继续培养；此后隔天换液，分种后第七天可获得P0代的神经干细胞，继续培养3‑4天获得P1代的神经干细胞；(3)将聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿置于37℃、5％CO2的培养箱中培养1h，接着在培养皿中添加神经元诱导培养基，再将步骤(2)传代后的P1代的神经干细胞接种到培养皿中，接种密度为2.5×104–5×104个细胞/cm2；神经元诱导培养基中要添加雷帕霉素以促进自噬的发生；培养2天后，将培养基更换为神经元细胞分化培养基，每3–4天更换一次培养基，培养至12‑15天可诱导分化为神经元细胞；步骤(1)所述的人诱导多能干细胞是指SCA3病人皮肤来源的人诱导多能干细胞；步骤(1)所述的人诱导多能干细胞是在无滋养层条件下培养得到的无分化或者仅含少量分化的克隆；步骤(1)所述的ROCK抑制剂为ROCK抑制剂Y27632；步骤(3)所述的神经元诱导培养基的组成与配比如下：1×的KnockOutTM DMEM/F‑12培养基97mL；2mM的GlutaMAXTM‑I添加剂1mL；20ng/mL的bFGF 20μL；20ng/mL的EGF 20μL；2％的Neural添加剂2mL；再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为100nmol/L；步骤(3)所述的神经元细胞分化培养基的组成与配比如下：1×的培养基97mL；2％的无血清添加剂2mL；2mM的GlutaMAXTM‑I添加剂1mL；再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为10nmol/L。