[发明专利]结核分枝杆菌复合群核酸检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种结核分枝杆菌复合群核酸检测方法，通过使用结核分枝杆菌复合群的特异性引物，利用交叉引物恒温扩增技术对样本中的结核分枝杆菌复合群核酸的靶基因特定片段进行扩增，然后通过分子信标对靶基因特定片段进行实时荧光检测以实现结核分枝杆菌复合群的筛查检测；所述方法以枯草芽孢杆菌为内控，用于对检测进行质量监控，具体是将枯草芽孢杆菌孢子与样本混合一起进行核酸提纯、扩增和检测；所述检测方法的所有过程在同一个试剂盒中进行，实现了核酸提取和纯化、核酸扩增及检测分析三个过程的全自动一体化。

主权项

1.结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒，其特征在于：包括主管(1)和主管(1)下方的支管(2)，支管(2)内设有第一分隔层(11)和第二分隔层(15)，所述第一分隔层(11)和第二分隔层(15)采用热变性材料，第一分隔层(11)位于主管(1)和支管(2)的连接处，第二分隔层(15)位于第一分隔层(11)下方；所述主管(1)内设有裂解液(10)，裂解液(10)内设有可被磁化的混匀装置(6)；第一分隔层(11)和第二分隔层(15)之间的空间被附加分隔层(13)隔为两个区间；两个区间内均设有清洗液(12、14)，第二分隔层(15)下方设有反应液(16)；所述主管(1)内设有纳米磁珠(7)和枯草芽孢杆菌孢子(8)；检测时，第一分隔层(11)和第二分隔层(15)通过被外部热源融化的方式使纳米磁珠可携带核酸移动至不同区间；还包括下述的所有引物；其具体检测方法是通过使用结核分枝杆菌复合群的特异性引物，利用交叉引物恒温扩增技术对样本中的结核分枝杆菌复合群核酸的靶基因特定片段进行扩增，然后通过分子信标对靶基因特定片段进行实时荧光检测以实现结核分枝杆菌复合群的筛查检测；所述检测方法以枯草芽孢杆菌为内控，用于对检测进行质量监控，具体是将枯草芽孢杆菌孢子与样本混合一起进行核酸提纯、扩增和检测；所述检测方法的所有过程在同一个结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒中进行，实现了核酸提取和纯化、核酸扩增及检测分析三个过程的全自动一体化；要进行扩增的靶基因特定片段为TB_IS6110和TB_gyrB327两组，且相应地利用两组不同的特异性引物同时进行两组扩增反应，并对两组扩增反应同时进行荧光检测，以实现两个反应体系下的检测；其中TB_IS6110片段为SEQ ID NO 21：CtgatgaccaaactcggcctgtccgggaccacccgcggcaaagcccgcAGGACCACGATCGCTGATCcggccacagcccgtcccgccgatctcgtccagcgccgcttcggaccaccagcacctaaccggctgtgggtagcagacctcacctatgtgtcgacctgggcagggttcgcctacgtggcctttgtcaccgacgcctacgctcgcaggatcctgggctggcgggTCGCTTCCACGATGGCCAcctccatggtcctcgacgcgatcgagcaagccatctggacccgccaacaagaaggcgtactcTB_gyrB327片段为SEQ ID NO 23：TCGACTCGGACGCGTATGCGATATCTGGTGGTCTGCACGGCGTCGGCGTGTCGGTGGTTAACGCGCTATCCACCCGGCTCGAAGTCGAGATCAAGCGCGACGGGTACGAGTGGTCTCAGGTTTATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGCCTCAAGCAAGGGGCGCCGACCAAGAAGACGGGGTCAACGGTGCGGTTCTGGGCCGACCCCGCTGTTTTCGAAACCACGGAATACGACTTCGAAACCGTCGCCCGCCGGCTGCAAGAGATGGCGTTCCTC针对TB_IS6110的结核分枝杆菌复合群的特异性引物包括以下序列：SEQ ID NO 1：TAGCAGACCTCACCTATGTGTCSEQ ID NO 2：TAGCAGACCTCACCTATGTGTCTTCGGTGACAAAGGCCACGTSEQ ID NO 3：ACAGCCCGTCCCGCCGATSEQ ID NO 4：AGGACCACGATCGCTGATCSEQ ID NO 5：TGGCCATCGTGGAAGCGASEQ ID NO 6：5‑FAM‑CGACGCAGCCGCTTCGGACCACCAGGCGTCG‑BHQ1‑3SEQ ID NO 7：CTGGGCAGGGTTCGCCT针对TB_gyrB327的结核分枝杆菌复合群的特异性引物包括以下序列：SEQ ID NO 14：TCGGACGCGTATGCGATASEQ ID NO 15：GCGATATCTGGTGGTCTGCSEQ ID NO 16：CGGTGGTTAACGCGCTATCSEQ ID NO 17：CGGTGGTTAACGCGCTATCAACCTGAGACCACTCGTACSEQ ID NO 18：GCGCCCCTTGCTTGAGGSEQ ID NO 19：FAM‑CGCCCGGCTCGAAGTCGAGATCAAGGGCG‑BHQ1SEQ ID NO 20：CGGCTCGAAGTCGAGAT其中，上述基因序列的方向均为5’‑3’，FAM为5’‑端标记的FAM荧光基团，BHQ1为3’‑端标记的BHQ1淬灭基团；所述枯草芽孢杆菌核酸中需要进行扩增的靶基因特定片段Bsu_rpoB473；Bsu_rpoB473片段为序列SEQ ID NO 22：gtgtatatttcagtggtaaagtagacaaaaacggtaaaaaaggttttaccgcaactgtcattccaaaccgtggcgcatggttagaatacgaaactgatgcgaaagatgttgtttatgtccgcattgatcgcacacgtaagttgccggttacggttcttttgcgtgctctcggcttcggttccgatcaagagattcttgatctcgtaggagagaacgagtacctgcgaaatacgcttgataaagataacacagaaaacagcgacaaagcgttgctcgaaattta针对Bsu_rpoB473的特异性引物包括以下序列：SEQ ID NO 8:TACCGCAACTGTCATTCCASEQ ID NO 9:CGTGGCGCATGGTTAGAATASEQ ID NO 10:CGTGGCGCATGGTTAGAATAAGAACCGTAACCGGCAACSEQ ID NO 11:GTATTTCGCAGGTACTCGTTCTCSEQ ID NO 12:TGTCCGCATTGATCGCACACSEQ ID NO 13:Cy5‑CGGCCGTGTCCGCATTGATCGCACACCGGCCG‑BHQ2其中，上述基因序列的方向均为5’‑3’，Cy5为5’‑端标记的Cy5荧光基团，BHQ2为3’‑端标记的BHQ2淬灭基团。