[发明专利]一种中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种快速、灵敏的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的双靶基因实时荧光PCR检测方法。本发明的检测方法针对中东呼吸综合征冠状病毒的E基因和N基因作为双靶基因进行扩增，本发明检测方法包括：标本处理，RNA核酸提取，RT-PCR扩增反应及荧光信号检测，其中RT-PCR扩增反应的特异性引物和探针是针对N基因和E基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株。本发明采用PCR及TaqMan荧光探针技术能对疑似中东呼吸综合征感染者标本中MERS-CoV的特异性核酸序列进行双靶基因扩增并检测，从而判断MERS-CoV的感染情况。通过本发明可大幅度提高出入境口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止重大中东呼吸综合征冠状病毒的输入。

主权项

一种中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：(1)标本处理：标本混匀后用于下一步核酸提取；(2)RNA核酸提取：利用裂解法裂解病毒，利用离心柱吸附进行核酸提取；(3)RT‑PCR扩增反应：a.RT‑PCR反应体系包括：RT‑PCR反应液,两对特异性正、反向引物和两条特异性探针混合液，逆转录酶/DNA聚合酶，RNase抑制剂，DEPC水,RT‑PCR质控品,标本RNA核酸；其中，所述的特异性引物和探针是针对N基因和E基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够区别其他病毒株。所述的特异性引物探针特异性引物和探针为：E‑Forward 5’‑GCAACGCGCGATTCAGTT‑3’SEQ ID NO1；E‑Reverse 5’‑GCCTCTACACGGGACCCATA‑3’SEQ ID NO2；E‑Probe 5’‑FAM‑CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG‑TAMRA‑3’SEQ ID NO3；N‑Forward 5’‑GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC‑3’SEQ ID NO4；N‑Reverse 5’‑TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT‑3’SEQ ID NO5；N‑Probe 5’‑VIC‑ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG‑TAMRA‑3’SEQ ID NO6；b.将上述混合好的反应液进行PCR扩增及荧光信号检测；(4)结果判定：根据扩增结果，判定感染情况。