[发明专利]来源于嗅粘膜神经元细胞分离制备技术

摘要

来源于嗅粘膜神经元细胞分离制备技术本发明提供了一种嗅粘膜神经元的分离培养、传代、冻存、分化技术。特色步骤包括：1、嗅粘膜神经元基础培养基的配置；2、原代培养技术；3、专用传代培养基的配置：收集处理培养基上清液，用于配置嗅粘膜神经元传代培养基；4、重复传代培养技术；5、冻存保护液的配置；收集处理培养基上清液，用于配置嗅粘膜神经元细胞冻存液；6、超低温冷冻保存；7、细胞复苏分化技术。本专利选取上鼻甲三分之一嗅区粘膜进行分离培养增殖、冻存、分化，并获得大量高纯度的嗅粘膜神经元细胞，目前大量基础和临床实验结果证明，该细胞具有综合神经修复作用，能有效改善神经系统疾病和损害患者的神经损伤功能和生存质量。

主权项

1.一种来源于嗅粘膜的神经元细胞的制备方法，其特征在于以下操作步骤：(1)嗅粘膜嗅神经元基础培养基的配制：用DMEM/DF12、IL‑2、胰岛素、T3、EGF、FGF、N2、B27、PDGF、NGF、TGF‑β2、BDNF、GDNF、BSA神经营养生长因子配制嗅粘膜嗅神经元基础培养基；(2)培养瓶包被：用多聚赖氨酸包被培养瓶；(3)原代培养：将获自上鼻甲三分之一嗅区粘膜的嗅粘膜组织块加入基础培养基混匀，转移至事先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中使其贴壁，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养，获取单细胞；(4)专用传代培养基的配制：收集要传代细胞培养基的上清液，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基并以上清液∶基础培养基＝0.5∶1的比例进行混合，制成专用传代培养基；(5)重复传代培养：按照1∶3的比例将步骤(3)原代培养获取的单细胞加入步骤(4)配制的传代培养基，制成细胞悬液，然后转移至事先用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养，重复传代；(6)冻存保护液的配制：收集要冻存细胞的培养基上清液，将人血白蛋白、细胞培养上清液、DMEM/F12、DMSO混合配制获得细胞专用冻存液；(7)超低温冷冻保存：收集细胞，按照比例加入步骤(6)配制的冻存保护液，按常规程序冷冻保存；(8)复苏分化培养：常规复苏冻存细胞后，用配制的神经元分化培养液培养。