[发明专利]一种口腔支原体的活体冻干体的制备方法

摘要

本发明公开了一种口腔支原体的活体冻干体的制备方法，包括原料和制备工艺。本发明采用在真空及低温的作用下使水分不经固化直接升华的冻干方法，将口腔支原体活体菌液脱水制成口腔支原体活体冻干体；利用活体冻干体能够在相对较高的温度(-20℃)下长期保存，且复原性好、不变异、保藏成本低、占用空间小、便于量产库存和运输特性的技术方案，克服了现有技术存在保藏时间短、易于变异、存活率低、成本高、不便于大量保存和运输的问题与不足，使口腔支原体活体的库藏，达到了延长保存期限，不变异、存活率高、成本低，便于大量保存和运输的目的。

主权项

一种口腔支原体的活体冻干体的制备方法，包括原料和制备工艺，其特征在于：所述的原料为：菌株：口腔支原体(ATCC 23714株)A培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基，试剂BR级；细胞培养剂：灭活新生牛血清，药用级生物制品；保护剂：脱脂牛奶，10％脱脂牛奶浓度，药用级生物制品；C溶剂：蒸馏水；D溶剂：注射用水，药用级；E溶剂：生理盐水，药用级；所述的制备工艺包括，菌液制备工艺和活体冻干工艺，其中，所述菌液制备工艺为：按A培养基1.0～2.0g，C溶剂50ml的比例，在三角瓶中对A培养基与C溶剂进行摇匀并40～50℃加热溶解，之后用50ml规格的试管分装成30ml/管，经高压灭菌121℃，15分钟处理，之后静置冷却至低于55℃，获得A基单管；按保护剂8～12g，D溶剂100ml的比例，在三角瓶中对保护剂与D溶剂进行摇匀混合，经高压灭菌115℃，15分钟处理，之后静置冷却至室温，获得稀保剂；在所述A基单管中加入细胞培养剂6～8ml，轻轻摇匀，勿使产生气泡，之后倾斜30°架置，静置凝结，制成斜面基，凝结后获得新生牛血清胰酪大豆胨琼脂斜面培养基的单管，简称血琼基斜单管，待用；按1∶1的比例用E溶剂将菌株复溶稀释，混合均匀后，用无菌吸管取出，均匀涂抹接种至所述血琼基斜单管的血琼基的表面上，之后，静置36℃±1℃中培养2～4天，届时所述血琼基的表面上生长出一层菌苔，用刮刀轻轻刮取所述菌苔，一只所述血琼基斜单管收获的所述菌苔量称为单管量，按单管量配比所述稀保剂20ml的比例，将所述菌苔移至三角瓶中与所述稀保剂进行混匀，获得高浓度的活体菌液；将所述活体菌液按0.3ml/管分装至冻干管中，管顶封以无菌棉花，防止微生物污染，获得菌液冻干管，待用；所述的活体冻干工艺，包括入柜、预冻、冷阱制冷、抽真空、第一阶段升温干燥、过渡升温阶段、第二阶段解析干燥、冻干结束和熔封保存，其中：步骤一、入柜将一只仅装有所述保护剂的冻干管作为温度测定管；将所述菌液冻干管排列装入冻干机的柜中，将所述温度测定管插列在其间，将冻干机的温度探头插入所述温度测定管内且浸没在所述保护剂中，所述菌液冻干管、所述温度测定管的底部均须与冻干机的搁板接触，设置冻干机的搁板温度为‑30℃～‑40℃，之后关闭柜门、开机，冻干机进行干箱制冷；步骤二、预冻当温度测定管内的温度降至‑40℃时开始预冻计时，预冻用时为3小时；步骤三、冷阱制冷预冻结束后，将冻干机由干箱制冷切换至冷阱制冷；步骤四、抽真空冷阱温度≤‑52℃之后，冻干机开启抽真空；步骤五、第一阶段升温干燥当干箱真空度达到＜10Pa后保持30分钟，之后，将冻干机搁板温度设为‑28℃，在保持真空度＜10Pa的条件下进行持续缓慢升温，升温用时13小时；步骤六、过渡升温阶段第一阶段升温干燥之后，保持真空度＜10Pa，将冻干机搁板温度设为0℃继续升温，升温用时30分钟；步骤七、第二阶段解析干燥过渡升温阶段之后，将搁板温度设为29℃，待所述温度测定管的温度达到28℃时开始保温计时，在保持所述温度测定管的温度28～29℃±.05的条件下进行解析干燥，保温用时＞8小时，获得口腔支原体的活体冻干体；步骤八、冻干结束第二阶段解析干燥之后冻干结束，由于冻干机中所述菌液冻干管内的口腔支原体活体菌液脱水成为活体冻干体，此时将冻干机中菌液冻干管改称为菌干冻干管；关闭冻干机及真空，取出所述菌干冻干管；步骤九、熔封保存用火焰熔封所述菌干冻干管的管口，熔封后，贴标，记录菌株名称、株号、批号、代次、制备日期、制备人，避光保存于‑20℃。