[发明专利]一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法及其应用和试剂盒

摘要

本发明提供了一种用于平行测定尿嘧啶‑DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法及其应用和试剂盒。当目标物为UDG时，若UDG存在，所述发夹探针中的U碱基被移除，产生一个AP位点，产生的AP位点被工具酶EndoIV切刻，释放出含自由3’末端的引物序列用于引发随后的滚环放大反应RCA；若UDG不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行；当目标物为EndoIV时，若EndoIV存在，其RCA过程与上述UDG活性检测中的RCA过程是一样的，若EndoIV不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行。其既能用作UDG的识别探针又能用作EndoIV的前体识别探针，因此简化了探针的设计。UDG和EndoIV的检测限分别低至0.00017U/mL和0.11U/mL，结果比其他免标记荧光方法更好或相当。

主权项

1.一种用于平行测定尿嘧啶‑DNA糖基化酶和内切酶IV活性的非诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：1)设计发夹探针和挂锁模板；所述发夹探针包括环部、颈部，所述颈部连接于环部的两端且具有互补的核酸序列，所述颈部具有U碱基序列，所述发夹探针具有设计在发夹结构的环部和颈部的RCA的引物序列；所述挂锁模板具有与自由3’末端的引物序列特异结合引发滚环放大反应的序列；2)将步骤1)制备的发夹探针，待检测的UDG和相应的EndoIV加入到反应缓冲液中，若UDG存在，所述发夹探针中的U碱基被移除，产生一个AP位点，产生的AP位点被工具酶EndoIV切刻，释放出含自由3’末端的引物序列用于引发随后的滚环放大反应RCA，获得荧光信号；若UDG不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行，无荧光信号产生；3)对步骤2)中产生荧光信号的RCA反应产物的荧光强度进行测定，构建荧光强度与UDG浓度之间的线性曲线，对某一样品，可通过测定样品的荧光强度，代入线性曲线，计算UDG浓度；4)将步骤1)制备的发夹探针，待检测的EndoIV和相应的UDG加入到反应缓冲液中，若EndoIV存在，所述发夹探针中的U碱基被移除，产生一个AP位点，产生的AP位点被工具酶EndoIV切刻，释放出含自由3’末端的引物序列用于引发随后的滚环放大反应RCA，获得荧光信号；若EndoIV不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行，无荧光信号产生；5)对步骤4)中产生荧光信号的RCA反应产物的荧光强度进行测定，构建荧光强度与EndoIV浓度之间的线性曲线，对某一样品，可通过测定样品的荧光强度，代入线性曲线，计算EndoIV浓度；其中，所述发夹探针的序列：GTGGTGAGGAGTGAGGTAGGTGGTATAAACTTAGGATCGTGTGGTTUATACCACCTACCTCACTCCTCACCAC；所述挂锁模板的序列：GATCCTAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAACCACAC。