[发明专利]一种多病原及耐药基因检测方法

摘要

本发明公开了一种多病原及耐药基因检测方法，同时针对34种造成败血症的细菌、7种真菌和5种耐药基因的检测，该方法包括：首先配置PCR反应液，然后进行PCR扩增；所述PCR反应液包括引物、分子探针、DNA聚合酶、20×Buffer、和dNTP，所述PCR扩增包括高温变性、低温复性和72℃延伸。本发明可同时检测导致败血症并威胁生命的34种细菌、7种真菌和5种耐药基因，且不依赖于培养的、病原来源的核酸浓缩，本发明基于多个PCR的病原荧光检测，可在6小时内给出高治疗指导价值的结果。

主权项

一种多病原及耐药基因检测方法，同时针对34种造成败血症的细菌、7种真菌和5种耐药基因的检测，其特征在于：首先配置PCR反应液，然后进行PCR扩增；所述PCR反应液包括引物、分子探针、DNA聚合酶、20×Buffer、和dNTP，所述PCR扩增包括高温变性、低温复性和72℃延伸；所述34种造成败血症的细菌中革兰氏染色阳性包括产气荚膜梭菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌链球菌、牛链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌、酿脓葡萄球菌和血链球菌，其相应的引物中的上游引物的序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15所示，下游引物的序列分别如SEQ ID NO.47～SEQ ID NO.61所示，其分子探针的序列分别如SEQ ID NO.93～SEQ ID NO.107所示；革兰氏染色阴性包括鲍氏不动杆菌、脆弱类拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯氏菌、摩根氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、粘质沙雷菌、嗜麦芽窄食单胞菌、颊普雷沃菌、中间普氏菌和产黑色普雷沃菌，其相应的引物中的上游引物的序列分别如SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.34所示，下游引物的序列分别如SEQ ID NO.62～SEQ ID NO.80所示，其分子探针的序列分别如SEQ ID NO.108～SEQ ID NO.126所示；所述7种真菌分别为：烟曲霉、白色念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯氏念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌，其相应的引物中的上游引物的序列分别如SEQ ID NO.35～SEQ ID NO.41所示，下游引物的序列分别如SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.87所示，其分子探针的序列分别如SEQ ID NO.127～SEQ ID NO.133所示；所述5种耐药基因分别为：甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药mecA、肠球菌万古霉素耐药vanA、肠球菌万古霉素耐药vanB、大肠杆菌β‑内酰胺酶blaSHV和大肠杆菌β‑内酰胺酶blaCTX‑M，其相应的引物中的上游引物的序列分别如SEQ ID NO.42～SEQ ID NO.46所示，下游引物的序列分别如SEQ ID NO.88～SEQ ID NO.92所示，其分子探针的序列分别如SEQ ID NO.134～SEQ ID NO.138所示。