[发明专利]一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法

摘要

本发明公开了一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法通过培养基从烟草表面分离甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发酵。本发明从烟叶表面分离获得降解甾醇的微生物，利用种子培养基进行扩大后获得对数期细胞，添加到烟草浸提液中可以有效降解其中的甾醇含量，甾醇总降解率达到35.5%。甾醇为烟草有害物质苯并芘的前体化合物，该发明为烟草生物减害提供参考，具有很高的原创性，有望应用于降低苯并芘的再造烟叶生产过程。

主权项

一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：通过培养基从烟草表面分离甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发酵；步骤如下：(1)降甾醇微生物的分离：用无菌水洗涤烟叶表面2‑3次，收集沉淀，将沉淀用15ml pH7.0的磷酸缓冲液稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，37℃摇床中，150r/min培养，于富集培养基中富集培养3次后，取200μl培养液涂于固体平板上，培养48h后获得可降解甾醇的微生物单菌落；(2)微生物扩大培养：挑取步骤(1)中的单菌落到种子培养基中，于37℃摇床中，150r/min培养48小时，获得种子培养液，保存于4℃，同时取0.5ml菌液加0.5ml的50％甘油混匀后保存于‑20℃；(3)以步骤(2)中的种子培养液为种子，重新取1ml接种到50ml新鲜的种子培养液中，相同条件下培养48小时，每隔5小时取2ml菌液，测定OD值，在18‑52h收集细胞，分别在6000转，4℃下离心30min，去掉上清液；(4)甾醇降解条件：收集18‑52h的细胞，并以质量1：50的比例将干细胞加入到烟草浸提液中，置于37℃的摇床中，150r/min下发酵2‑8h；所述步骤(1)中分离培养基的组分：以分离培养基总量1L计，豆甾醇2.0±0.1g；葡萄糖2.0±0.1g；失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚1±0.1ml；柠檬酸2.0±0.1g；K2HPO4 0.5±0.01g；NH4Cl 1.0±0.1g；余量为水。