[发明专利]一种产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法

摘要

本发明为一种产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法，属于生物化工技术领域，蛋白质工程。本发明所述筛选方法的具体步骤依次包括：样品采集、初筛、菌种复筛和β-半乳糖苷酶的酶活性测定。本发明主要采用采集温泉地的土壤并煮沸进而筛选菌落、在高温下培养筛选的方法解决如何在高温下生产出高酶活的β-半乳糖苷酶的技术问题。该菌株产β-半乳糖苷酶的周期短、速度快、遗传稳定性好、热稳定性好、pH稳定性好、酶催化活力强，且培养条件简便、生产安全性高。在食品工业、医学及生化分析领域，尤其是乳品工业中具有广阔的前景。

主权项

一种产耐高温β‑半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品采集：土壤样品采于温泉及牛奶场土壤；(2)初筛：初筛：将1～2g土样置于10～20ml蒸馏水中，混合均匀后做梯度稀释，移取120μL菌液均匀涂抹于筛选培养基平板上，放置于30℃培养箱中培养24～48h；从筛选培养基平板上挑取周围带有蓝色水解圈的单菌落划线，反复划线3次，得到纯培养物将1～3％在35℃固体培养基划线中，在35℃培养36～48h，取其中的3～5个单菌落在液体培养基35℃培养12～24h，取1～3％接种于固体培养基中在45℃固体培养基划线中，培养36～48h，取其中的3～5个单菌落在液体培养基45℃培养12～24h，取1～3％接种于固体培养基中在55℃固体培养基划线中，在55℃培养36～48h，取其中的3～5个单菌落在液体培养基65℃培养12～24h，取1～3％接种于固体培养基中在65℃固体培养基划线中，在65℃培养36～48h，取其中的3～5个单菌落在液体培养基65℃培养12～24h，取1～3％接种于固体培养基中在75℃固体培养基划线中，在75℃培养36～48h，取其中的3～5个单菌落在液体培养基75℃培养12～24h，发现其不生长，取65℃仍然生长的菌株1％～3％，将其接种于固体培养基，70℃培养24～36h，发现其仍能生长，所以其最适温度在65℃～70℃。得到纯培养物后转接斜面保藏；(3)菌株复筛：将初筛后经分离、纯化得到的菌株分别挑取2～3环接入种子培养基，在65～70℃和200～300r/min的条件下活化24～36h，再以2％(v/v)的接种量接入到装有40ml发酵培养基的250ml三角瓶中，用相同的条件下培养24～36h；再在4～5℃下冷冻离心(10000～12000r/min，10～15min)发酵液，取上清液和破碎后菌体分别测定β‑半乳糖苷酶的水解酶活，确定β‑半乳糖苷酶为胞内酶或胞外酶，从而筛选β‑半乳糖苷酶高产菌株(4)β‑半乳糖苷酶的酶活性测定：使用比色法测定酶活；将2～3mg ONPG溶于2～3ml磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液中，预热后加入适当稀释的酶液0.5～2.5ml，在55～65℃下反应15～20min，加入0.15～0.25mol/L的碳酸钠溶液2.5～3.5ml将反应终止，静置5～10min，在420nm测其产物ONP的光吸收值；β‑半乳糖苷酶酶活性的定义：在上述条件下，酶催化领硝基酚‑β‑D‑半乳糖苷(ONPG)反应1min生成1μmol领硝基酚产物(ONP)所需的酶量。所述的筛选培养基的成分为乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 4g/L、X‑gal 0.035g/L、牛肉膏10g/L，琼脂20g/L，条件为pH 7.0。所述的斜面保藏培养基的成分为乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 4g/L、琼脂20g/L，条件为pH 7.0。所述的种子培养基的成分为乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸膏10g/L、NaCl 4g/L，条件为pH 7.0。所述的基础发酵培养基的成分为乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸膏10g/L、氯化钙0.11g/L、硫酸锰0.001g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾0.05g/L、硫酸亚铁0.03g/L，条件为pH 7.0。