[发明专利]一种具有高CO2耐受性和固定率的微藻选育方法

摘要

本发明属于微藻培育技术领域，涉及一种具有高CO₂耐受性和固定率的微藻选育方法，具体包括以下步骤：样品的采集与预培养—模拟烟气驯化培养—平板分离—较纯种群的采集—获得纯种群—纯种保存—培养特性测定—高强度驯化培养—基因诱变育种—传代稳定性测定—基因克隆和测序—藻株的碳含量测定—目标株的培养特性测定—确定优选目标株，所培育出的菌株具有最大条件下的CO₂耐受性；整体方法原理科学，步骤清晰，易于操作，条件可控。

主权项

一种具有高CO₂耐受性和固定率的微藻选育方法，其特征在于具体包括以下步骤：(1)样品的采集与预培养：采集土壤、池塘、自然河流、排污塘、电厂水塘中的水样作为试验样品，培养前将上述各水样在光学生物显微镜下进行观察，分别记录所含微藻的种类；在反应器6中按1：3的容量比例加入所取样品及已灭菌的BBM培养基，将微藻混合试样接种到该培养基里，在光照培养箱中进行培养，控制培养条件为：25℃±2℃，光照强度25000Lux，光暗比12：12,培养液初始pH值为6；预培养3周待明显变绿后，按上述步骤继续进行扩大培养，培养方法同上；(2)模拟烟气驯化培养将预培养后的微藻试样装入新的反应器6内进行驯化培养，将配制的含有体积比为CO₂15％、N₂83％和O₂2％的模拟烟气通入反应器中，控制气流速度大于60mL/min，光照强度为11000Lux，光照周期为10h：14h，驯化培养4天；取驯化后的藻液接种到新的反应器6的培养基中，依照上述方法反复驯化培养三次得高密度藻液，然后采用平板分离法进行微藻分离试验；(3)平板分离将上述高密度藻液接种在平板上，控制温度21℃‑25℃，光照强度25000Lux，光照周期12:12，培养6‑8天并观察藻落生长情况；待单藻落形成时，挑取部分藻落在显微镜下观察，选取较多同一种属的进行分离和采集；(4)获得纯种群并进行保存将步骤(3)反复多次进行多代培养，直至单菌落特征一致，且显微镜下观察为唯一种属时确定为纯菌落藻种而进行保存；将纯菌落藻种接种于斜面培养基中，放置于恒温培养箱中控温4℃保存，1‑2个月转接一次，直至长出清晰藻落；(5)培养特性测定按体积比1:9取对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的BBM培养基中，设置不同温度、气体流速、光照条件和培养基初始pH值一系列培养条件进行寻优试验以得出最佳培养条件；(6)高强度驯化培养按体积比1:9取对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的MBM培养基中，分别在CO₂浓度为3％、5％、10％、15％、20％、30％、60％和80％及普通空气条件下培养6天时间，观察微藻的生长情况，考察并记录微藻对高浓度CO₂的耐受性，以筛选获得耐受性相对高的菌株；(7)基因诱变育种根据致死率为70‑80％有利于正向突变的原则，通过预实验确定适合的诱变剂量后进行紫外线诱变选育；选择诱变剂量为紫外线照射30min，处理OD680nm分别为0.020、0.031、0.035、0.046、0.055和0.088的藻液，并根据细胞致死率确定初始藻细胞浓度；上述不同取值下OD680nm的每个诱变试验做3个平行样后取其平均值，诱变后预培养同步骤(1)的预培养过程，然后按照步骤(3)和(4)筛选出单株优良藻株；(8)传代稳定性测定将筛选得到的单株优良藻株分别接种入新的反应器6内新鲜培养液中连续培养四代，并对第四代藻株测其生长曲线与第一代藻株比较，得到稳定突变株后再进行下个步骤，否则重复步骤(7)和(8)直至得到稳定突变株；(9)基因克隆和测序①菌液与质粒将得到的生长稳定的稳定突变株制成菌液，以大肠杆菌和PMG为质粒载体；②缓冲液及试剂TAE：40mM Tris‑acetate,10mM EDTA，EB：1gEB溶于100ml蒸馏水中，放于棕色瓶中避光保存，试剂：植物基因组DNA提取试剂盒Plant Genomic DNAKit，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit；③藻细胞DNA的提取取15ml对数生长期的菌株，在4300g下离心15min后转接到离心管在‑20℃条件下冻结；取出离心管在室温条件下溶解，在12000rmp离心30s，对沉底的组织进行物理破碎；将65℃预热的700μl缓冲液GP1转入离心管中迅速颠倒混匀后，放在65℃水浴中20min，该过程中多次颠倒摇晃以混合样品；加入700μl氯仿充分混匀，在12000rmp下离心5min；将所得上层水相转入新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2充分混匀；将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rmp下离心30s后弃掉废液；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液；将吸附柱CB3中放回收集管中，12000rmp下离心2min后倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置，以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入新的干净离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl pH值在7.0‑8.5之间的水，室温放置2‑5min，12000rmp离心2min，将溶液收集到离心管中；将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rmp离心2min得DNA产物，将DNA产物保存在‑20℃，以防DNA降解；④引物设计从Genebank中获得菌株的rbcL基因序列，引物设计采用ClustalX 1.8软件进行分析。按以下原则进行筛选：引物要与模板序列紧密互补，引物间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物特异性要高以避免错误引发，引物Tm值在55‑65℃、GC含量在40‑60％，引物的3’端避免使用碱基T，3’端避免出现3个以上的连续相同碱基，不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体；选择最保守的区域得到引物；⑤PCR反应体系和反应条件PCR反应体系为：25μl的2×PCRTaqMix，两个1μl的50mMPrimer，2μl的模板DNA；用ddH2O将总体系补足到50μl；反应循环条件：94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，反应最后72℃延伸7min；1ml的2×PCRTaqMix中含有：100nM kcl、20nM Tris‑HCL、3nM Mgcl2、400Μm dNTP混合物、0.1U/μl Taq DNA聚合酶、溴酚蓝和其他增强剂与稳定剂；取2μl PCP产物用于电泳检测，检测是否有明显的目的条带，然后切胶回收目的片段；⑥普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒试剂盒组成：平衡液BL，溶胶液PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，吸附柱CA2，收集管；⑦PCR产物连接pBS‑T连接试剂盒连接反应体系为：1μl的pBS‑T载体，1μl的10×T4DNALigationBuffer，1μl的T4DNALigation，5μl的目的PCR片段，用ddH2O将总体系补足到10μl；30℃反应2h后，全量转化至50μl TOP10感受态细胞中；⑧连接产物的转化将连接反应液10μl全部转化至50μl TOP10感受态细胞中，轻轻混匀置于冰上放置30min；将收集管置于42℃水浴中热激90s，迅速转入冰浴中2min；加入200μl LB液体培养基，37℃、220rmp震荡培养45min；取200μl上述转化培养物涂至含有Amp的LB平板上，待所有液体被吸收后，37℃倒置培养14h左右，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时取出平板；⑨挑取单克隆抗体每个试样挑取20个克隆单体放入离心管中，向离心管中加800μl含有AMP的LB培养液，再置于37℃恒温摇床上220rmp培养3h，然后取少量菌液用于PCR检测，其他用于保种和测序；⑩PCR法检测阳性克隆阳性克隆检测的PCR反应体系为：25μl的2×PCR TaqMix，两个1μl的50mM Primer，2μl的菌液，用ddH2O将总体系补足到50μl；反应循环条件：94℃预变性7min，94℃变性1min，42℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，反应最后72℃延伸7min；将在1.2kbp出现条带的菌液用于测序和保种，采用pBS‑T载体测序通用引物测序；(10)藻株的碳含量测定采用全自动元素分析仪分别对原始水样中的藻株和得到的稳定突变株的碳含量进行测定对比；(11)目标株的培养特性测定采用正交试验方式，在微藻选育装置中确定出适合目标株的最高耐CO₂的浓度、最适宜的培养温度、气体流速、光照条件、初始pH值和N源一系列培养条件，从而得到最终优选的目标株，实现具有高CO₂耐受性和固定率微藻的选育。