[发明专利]一种生乳细菌总数荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种生乳细菌总数荧光定量PCR检测方法，属于食品卫生微生物快检速验领域。运用荧光定量PCR技术，定量生乳样品中细菌16SrDNA，针对污染菌谱中不同菌株建立细菌浓度(国标法计数)与荧光定量PCR的CT值之间的标准曲线，分析不同菌株浓度为2×10⁶CFU/g(mL)时其标准曲线对应CT值，确定CT值范围，在以期根据CT值判断鲜乳中的细菌是否超标，完成对鲜乳的质量等级的确定。优点是，使用本方法的准确率在90%以上，检测时间在4h左右，是一种快速检测鲜乳细菌总数的新方法，能够为鲜乳样品的质量等级进行快速的确定。

主权项

一种生乳细菌总数荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括下列步骤：（一）分离鉴定生乳中细菌种类，并确定污染菌谱包括以下13株菌：格式乳球菌、中间葡萄球菌、血链球菌、克氏库克菌、阴沟肠杆菌、溶血性葡萄球菌、大肠埃希菌、蜂房哈夫尼亚菌、阪崎肠杆菌、绿浅气球菌、雷根斯堡约克氏菌、粘质沙雷菌、产酸克雷伯菌；（二）分析污染菌谱中细菌序列，并设计16SrRNA通用引物：引物1：5’‑GCCACTCCTCAAGGGAACAA‑3’引物2：5’‑TGACGCTCAGGTGCGAAAG‑3’（三）生乳样品前处理方法：取1mL行乳，12000g/min离心5min，弃掉上层脂肪与上清，无菌生理盐水洗两次，12000g/mL离心2min，无菌水重悬下层沉淀，100℃沸水浴30min提取细菌DNA，同时采用国标法计数加标样品细菌总数；（四）以步骤（三）得到的DNA为模板进行荧光定量PCR反应：20μL反应体系包括：Power SYBR Green PCR Master Mix 10μL，上、下游引物各0.5μL，去离子水8μL，模板DNA 1μL；反应条件：95℃预变性 10 min，95℃变性30 s，59 ℃，退火50 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；（五）检测结果判定标准建立细菌常见污染菌谱中13种菌的细菌浓度（logCFU/mL）与CT值的标准曲线，分析不同细菌标准曲线，确定细菌浓度为2×10⁶ CFU/mL时对应的CT值，污染菌谱中蜂房哈弗尼亚菌CT值最低为：29.4 ，溶血性葡萄球菌CT值最高为：32.7 ；当检测样品的CT值﹥32.7时，样品为合格产品，可作为生乳；当CT值<29.4时，细菌总数超过2×10⁶ CFU/mL，样品为不合格产品；介于范围内的细菌总数2×10⁶ CFU/mL不应作为低温乳品的原料。