[发明专利]一种黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法

摘要

本发明涉及一种快速、简便、灵敏的黄热病毒((YellowFever Virus))IgG抗体的间接免疫荧光检测方法。本发明的检测方法原理是以间接免疫荧光法检测人抗黄热病毒病毒抗体。载玻片上是包被能表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞，阳性对照或阳性样品中抗NS1蛋白抗体在结合到细胞表面后，用荧光染料标记二抗捕获后在荧光显微镜下观察，可见绿色的荧光细胞，判定为黄热病毒IgG抗体阳性。若样本中无黄热病毒抗体，细胞不显示荧光。检测方法包括如下步骤：293F细胞载波片的制备，载波片上加入样本，荧光标记二抗的结合，洗涤，荧光检测，结果判定。本发明能对黄热病毒进行快速灵敏的检测，操作简便，通过本发明可大幅度提高出入境口岸一线检验检疫人员的检测效率，对防控外来烈性传染病的输入具有重要意义。

主权项

1.一种非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：(1)表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载玻片的制备:将Expi293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度调整至4X105个/毫升后，在腔室玻片Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于细胞培养箱中培养24小时；此时细胞基本铺满孔底，再用黄热病毒NS1蛋白的全长基因表达质粒进行细胞转染；用脂质体2000转染质粒，以1ug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进行；细胞转染48小时后，得到表达的黄热病毒NS1蛋白，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完成再进行5％山羊血清封闭，封闭后用10％甘油封片2‑8℃冷藏保存；所用的黄热病毒为病毒株AEQ35299；(2)样品稀释液和洗液的配置；(3)表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载玻片的平衡：将表达有黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载玻片Chamber Slide从2‑8℃取至室温中，放置10分钟；(4)加入待测样品、阳性对照、阴性对照；所述的阳性对照为抗黄热病毒NS1蛋白的兔阳性血清，其制备包括如下步骤：将表达黄热病毒毒株AEQ35299蛋白的全长基因经分子克隆的方法克隆到IneratorTM载体后，用基因免疫的方法免疫新西兰大白兔，经首次免疫、二次免疫后，耳静脉采血收集少量抗血清，经间接ELISA的方法检测抗血清的效价，效价检测>1:64000后进行加强免疫，二次免疫间隔3周后，10天之后收集抗血清；所述的阴性对照为未免疫新西兰大白兔,制备过程同阳性对照；(5)吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次；(6)加入荧光标记二抗；(7)吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍；(8)结果判定：将载玻片Chamber Slide置于荧光显微镜下观察荧光,判定结果，有绿色荧光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有黄热病毒抗体。