[发明专利]一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法

摘要

本发明涉及一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，包括以下步骤：S1、敲除单纯疱疹病毒Ⅰ型的UL5基因，制备BAC-HSV-△UL5质粒；S2、制备表达UL5蛋白的Vero细胞；S3、微载体扩增培养S2所述的表达UL5蛋白的Vero细胞；S4、制备病毒悬液；S5、将S4制备的病毒悬液添加到S3中应用微载体培养的培养基中；S6、收集培养液上清，过滤，得病毒液；S7、病毒液加入冻干保护剂，制成疫苗。本发明提供的方法可以实现工业大规模生产高质量的单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗，同时，本发明制备的疫苗可以安全有效的激活人体的免疫应答，降低疱疹病毒对人体的感染。

主权项

一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、敲除单纯疱疹病毒Ⅰ型的UL5基因，制备单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失质粒，即BAC‑HSV‑△UL5质粒；S2、构建pcDNA3.1‑UL5真核表达质粒并转染到Vero细胞，使Vero细胞表达UL5蛋白，制备表达UL5蛋白的Vero细胞；S3、微载体扩增培养S2所述的表达UL5蛋白的Vero细胞；S4、将S1所述的BAC‑HSV‑△UL5质粒转染至不加微载体常规培养的表达UL5蛋白的Vero细胞中，3‑5天后观察到细胞有病变并且出现空斑，再收集细胞反复冻融获得病毒悬液；S5、将S4收集的病毒悬液按病毒感染复数MOI为0.001:1的量接种病毒到S3中应用微载体培养的表达UL5蛋白的Vero细胞培养基中；S6、收集S5中的培养液上清，过滤，得病毒液；S6、病毒加入冻干保护剂，制成疫苗；所述单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因敲除制备BAC‑HSV‑△UL5质粒的方法包括以下步骤：1）制备UL5同源重组片段UL5‑Kam‑sacB；2）将UL5‑Kam‑sacB基因片段转染至含有BAC‑HSV‑1质粒的大肠杆菌中，经卡那霉素挑单克隆筛选出插入了UL5‑Kam‑sacB基因片段的大肠杆菌；3）鉴定UL5成功敲除的菌落，提取BAC‑HSV‑△UL5质粒。