[发明专利]RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹果抗病育种中的应用

摘要

本发明属于生物育种领域，具体涉及一种RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹果抗病育种中的应用，该表达载体由以下步骤制成：（1）RT‑PCR扩增获得目的基因片段；（2）表达载体的构建。该表达载体在苹果抗病育种中的应用方法包括以下步骤：（1）将RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体转入根癌农杆菌；（2）苹果叶盘受体材料的无菌培养；（3）用农杆菌介导法转化苹果获得转基因材料；（4）转基因植株的检测；（5）对所得转基因阳性植株进行离体扩繁，移栽，即得。本发明将含有苹果茎痘病毒外壳蛋白（CP）基因保守片段的RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体遗传转化苹果，获得的转基因植株可以获得抗病毒的特性，在果树生产中具有良好的应用前景。

主权项

1.RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体在苹果抗病育种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）将RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体转入根癌农杆菌：用冻融交替法将RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体转化农杆菌菌株，转化后进行阳性克隆的筛选鉴定；所述RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体由以下步骤制成：a. RT‑PCR扩增获得目的基因片段：依据Genebank上登录号为HM12156.1的ASPV病毒外壳蛋白基因全长序列，在保守区段设计合成引物ASPV‑F和ASPV‑R，其中ASPV‑F序列如SEQ ID NO.1所示，ASPV‑R序列如SEQ ID NO.2所示；用Trizol法从感病的苹果叶片中提取植物总RNA，通过反转录获得cDNA第一链，并以此为模板、利用所合成引物进行PCR扩增，获得如SEQ ID NO.7所示目的基因片段；将目的基因片段切胶回收，连接至T载体，测序验证；b. 表达载体的构建：利用TOPO‑Cloning技术构建入门克隆载体，再利用LR反应构建RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体；所述利用TOPO‑Cloning技术构建入门克隆载体的步骤为： 取含目的基因片段的PCR回收产物1 μL，构建6 μL反应体系：回收目的基因片段ASPV 1μL、平衡盐溶液 1μL、pENTR™/SD/D‑TOPO® 载体 1μL、灭菌超纯水3 μL， 25℃反应30min，热激法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将转化细胞均匀涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养16h后，挑单克隆到含有相同浓度卡那霉素的 LB液体培养基中，37℃震荡培养14h，分别以ASPV‑F与ASPV‑R和通用引物M13‑F与ASPV‑R为引物进行菌液PCR扩增；如果扩增片段的长度明显大于插入片段的长度，即为构建好的入门克隆载体，命名为pENTR‑ASPV；所述利用LR反应构建RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体的步骤为：取pENTR‑ASPV质粒2μL、pHELLSGATE12 2μL、LR酶 4μL、灭菌水 12μL，25℃反应12 h 后加入2μL 蛋白酶K，37℃温浴10min终止反应；反应产物热激法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将转化细胞均匀涂布在含有100 mg/L壮观霉素的LB固体培养基上，37℃培养16h后挑单克隆到含有相同浓度壮观霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养14h后，分别提取LR反应后的单克隆和pHELLSGATE12空载质粒，先用ASPV‑F和ASPV‑R作引物进行菌液PCR，阳性质粒分别用XbaⅠ和XhoⅠ进行单酶切鉴定，将构建好的RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体命名为pH‑ASPV；所述筛选鉴定的方法为：将所述RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体转化农杆菌菌株后，分别用如SEQ ID NO.1所示序列的ASPV‑F与如SEQ ID NO.2所示序列的ASPV‑R、如SEQ ID NO.4所示序列的P35S‑F与ASPV‑R以及如SEQ ID NO.5所示序列的NPTⅡ‑F与如SEQ ID NO.6所示序列的NPTⅡ‑R作引物进行菌液PCR扩增，如果用ASPV‑F与ASPV‑R作引物PCR扩增出现493bp大小的片段，且以NPTⅡ‑F与NPTⅡ‑R作引物扩增片段大小为714bp，说明RNAi载体已成功转入农杆菌中，即为可用于侵染植物的RNAi工程菌，命名为EH‑ASPV；（2）苹果叶盘受体材料的无菌培养：采集田间材料，并进行消毒处理，再进行无菌营养的继代培养，以及叶盘的切割与预培养；（3）用农杆菌介导法转化苹果获得转基因材料：将步骤（2）中获得的苹果叶盘在MS+6‑BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基上预培养2天后，将EH‑ASPV菌液28℃震荡培养至OD=0.5，6000rpm离心10min后收集沉淀的菌体，用等体积的MS液体培养基重悬菌液，浸泡侵染叶盘10 min后，用无菌滤纸吸干多余的菌液，接种在MS+6‑BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基上暗培养3d，转至MS+6‑BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+Cef250mg/L培养基上进行脱菌培养，7d后转至MS+6‑BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+Kan50mg/L+Cef250 mg/L培养基上进行筛选培养，切取获得的抗性芽接种在MS+6‑BA0.5mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L培养基上，每2周继代一次，连续继代3次后，将发育良好的抗性芽转至1/2MS +NAA0.2+Kan50mg/L+Cef250mg/L培养基中进行生根培养；（4）转基因植株的检测：对所得转基因植株进行PCR初检，然后进行Southern杂交检测；（5）对所得转基因阳性植株进行离体扩繁，移栽，即得。