[发明专利]测定样品中PIK3CA突变状态的方法

摘要

本发明涉及用于检测癌症患者的生物样品中的PIK3CA突变的超灵敏和高度特异的方法，该方法基于来自以下项中的DNA样品的等位基因特异的、不对称快速PCR和解链分析的组合：循环肿瘤细胞(CTC)、血浆/血清中的无细胞DNA(cfDNA)、或福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPE)。使用针对外显子9和20(分别是E545K和H1047R)中的每个热点突变的等位基因特异性引物，根据本发明检测可以增强突变体PIK3CA等位基因序列的扩增，然而每个外显子的相应竞争性阻断未标记探针的存在可避免野生型PIK3CA序列的非特异性扩增，从而提高方法的灵敏度和特异性。使用未标记探针与突变体PIK3CA序列的DNA模板的解链曲线分析完成该突变检测。对癌症患者的外周血中的CTC及血浆/血清中的cfDNA的PIK3CA突变状态的评价是具有潜在临床应用的策略，并且可能对治疗性干预有重要影响，因为PIK3CA突变的存在与对分子靶向治疗的响应相关联。

主权项

一种用于分析DNA样品中PIK3CA突变等位基因DNA的存在的方法，所述方法包括以下步骤：进行所述突变等位基因DNA的非对称的和等位基因特异的聚合酶链反应(PCR)，以及进行在该PCR中产生的DNA的解链分析，其中所述PCR通过使用以下项来进行‑与有待扩增的突变等位基因DNA的第一链的3'(三撇)端互补的突变等位基因特异性引物，和‑未标记阻断探针，其是在一对应位置处与对应于该突变等位基因DNA第一链的野生型DNA第一链的野生型序列互补的寡核苷酸，在该对应位置中存在有待检测的突变并且在PCR反应中所述探针被阻断而不作为用于DNA合成的引物，和‑一个通用引物，其与有待通过该PCR扩增的突变等位基因DNA的第二链的3'端互补，并且其中所述解链分析通过使用以下项来进行‑为未标记探针的解链探针，该解链探针是一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含与野生型等位基因DNA互补的序列并且与突变等位基因DNA的序列重叠，和‑用于测量双链DNA组分的解链温度的可检测组分，该双链DNA组分至少包括结合到扩增的突变等位基因DNA链或野生等位基因DNA链的解链探针的双链组分，其中该解链温度在结合到扩增的突变等位基因链的解链探针的双链组分与结合到扩增的野生等位基因链的解链探针之间不同。