[发明专利]通过用内切H共表达的体内N-去糖基化重组蛋白质的生产

摘要

植物已经成为一种替代的表达系统，并且越来越多地被工业和学术界用于生产靶蛋白。然而，植物使蛋白质糖基化的能力对于那些不需要N‑糖基化的蛋白质可能是显著的限制。例如，恶性疟原虫蛋白或人类因子XIII的A链不携带N‑连接的聚糖，或炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)不是糖蛋白；然而，这些蛋白质含有潜在的N‑连接的糖基化位点，其可能在酵母菌、哺乳动物或植物系统中的表达期间异常地被糖基化，由于表位的不正确/变异的折叠和/或掩蔽，可能导致降低的功能性和免疫原性。为了克服这个问题，我们最近通过使用植物中的瞬时表达与细菌PNGase F(肽：N‑糖苷酶F)共表达开发了体内蛋白质的酶促去糖基化的策略(WIPO专利申请WO/2012/170678)，这允许生产可提供高传播阻断(TB)活性的疟疾疫苗候选物Pfs48/45(Mamedov等人，2012)。此外，与糖基化的形式相比，其他去糖基化的抗原在小鼠中诱导了显著更高水平的毒素‑中和抗体应答(Mamedov等人，原稿已提交)。尽管PNGase F处理(体内去糖基化)完整地除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成天冬氨酸(D)，导致去糖基化的蛋白中的氨基酸改变。在这项研究中，开发了一种策略，用于在植物中生产以非N‑糖基化形式的靶蛋白，但是所得到的去糖基化的蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变，这可以提高具有天然样折叠的植物或其他真核系统中的非N‑糖基化重组蛋白质的生产。因此，本发明描述了使用瞬时表达系统、通过在植物中与内切‑β‑N‑乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H)共表达，用于重组N‑糖基化蛋白质的体内去糖基化的材料和方法。还提供了在植物中表达活性内切H的方法。

主权项

1.一种用于产生N‑去糖基化的感兴趣的多肽的方法，该方法通过使用：(a)包含编码细菌内切H(内切‑β‑N‑乙酰氨基葡糖苷酶H，内切H，EC3.2.1.96)的第一核苷酸序列的第一核酸，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至启动子，使得当所述启动子被激活时，内切H多肽被表达；和(b)包含编码所述感兴趣的多肽的核苷酸序列的第二核酸，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接至启动子，使得当所述启动子被激活时，所述感兴趣的多肽被表达，(c)以及其中通过所述内切H多肽的作用，所述感兴趣的多肽被去糖基化，在所得多肽的NxS/T位点(序列)中没有氨基酸改变，与PNGase F的作用相反，由于在NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成为天冬氨酸(D)，PNGase F导致在去糖基化的蛋白质靶中的氨基酸改变，(d)包含编码细菌内切H(内切‑β‑N‑乙酰氨基葡糖苷酶H，内切H，EC3.2.1.96)多肽的第一核苷酸序列的第一核酸，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至启动子，使得当启动子被激活时，所述内切H多肽被表达，以及包含编码感兴趣的靶多肽的核苷酸序列的第二核酸，(e)通过所述内切H多肽的作用，所述感兴趣的多肽被去糖基化，在NxS/T位点(序列)中没有氨基酸改变，和(f)通过所述内切H多肽的作用，所述感兴趣的多肽被去糖基化，并且内切H多肽切割，使得一个GlcNAc残基与天冬酰胺连接，剩余的单糖赋予电荷，由此提高了去糖基化的多肽的溶解度和稳定性，和(g)生产非糖基化的疫苗抗原、治疗性蛋白质、抗体和细菌蛋白质(尤其是疫苗抗原候选物)酶。此外，本发明可以用于在任何真核体系中生产工业酶，尤其是细菌源酶，用于提高生物质能/生物燃料的产量，以及改善食品质量，特别是用于生产天然添加剂。