[发明专利]一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用

摘要

本发明涉及一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法，应用一套4条病毒基因组特异性引物(基因序列如序列表所示)以病毒基因组cDNA为模板进行扩增，扩增产物经纯化后连接至线性化双元载体，将重组的双元载体导入农杆菌并接种植物并用于CWMV的温度敏感性分析，结果分析显示本接种方法不仅能够获得CWMV侵染的植物病株，而且十分高效，表明本方法适用于中国小麦花叶病毒的接种，可用于相关病毒生物学特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。

主权项

一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法，包括以下步骤：1)引物设计：通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设计4条引物，其中引物对R1f/R1r用于扩增RNA1,引物对R2f/R2r用于扩增RNA2；2)病毒基因组扩增反应：以病毒基因组cDNA作模板，采用高保真的Phusion DNA聚合酶进行扩增，其中引物对R1f/R1r扩增的RNA1产物长约7.2‑kb，引物对R2f/R2r扩增的RNA2产物长约3.6‑kb；3)病毒基因组克隆：病毒全长基因组RNA1、RNA2扩增产物经切胶纯化后，采用In‑Fusion克隆试剂盒参照商家说明书分别连接至线性化的双元载体质粒上，测序验证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组双元载体质粒，然后利用电转化仪将含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒分别导入农杆菌；4)人工接种：将含有中国小麦花叶病毒基因组的农杆菌等量混合，然后通过注射器将农杆菌混合液浸润入植物体内，2周后进行病毒分子检测并观测植株表型变化。