[发明专利]一种高抗霉活性抗菌脂肽V7-surfactin的制备方法

摘要

一种高抗霉活性抗菌脂肽V₇‑surfactin的制备方法，以纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）为菌种，固态发酵法制取高抗霉活性surfactin [其结构简式为：Cyclo（C₁₄BOHFA‑E₁‑I/L₂‑I/L₃‑V₄‑D₅‑I/L₆‑V₇），分子量为1008Da，简称V₇‑surfactin]。该方法工艺步骤简单，产物分离纯化容易，所得V₇‑surfactin对多种霉菌具有广谱的抗性，比其他菌种来源的surfactin安全性更高。该方法制取V₇‑surfactin的得率为800‑1100mg/L培养基，纯度为85‑99%。

主权项

1.一种高抗霉活性抗菌脂肽V₇‑surfactin的制备方法，其特征在于，以纳豆芽孢杆菌为菌种，用固态发酵法制取高抗霉活性抗菌脂肽V₇‑surfactin；V₇‑surfactin的结构简式为：Cyclo（C₁₄BOHFA‑E₁‑I/L₂‑I/L₃‑V₄‑D₅‑I/L₆‑V₇）；包括以下步骤：（1）纳豆芽孢杆菌种子液的制备；（2）按照以下配方制备发酵培养基：葡萄糖20‑40g，酵母浸出粉1‑5g，大豆蛋白胨4‑6g，Na₂HPO₄ 1‑2g，KH₂PO₄ 0.5‑1.5g，丙氨酸0.2‑0.6g，谷氨酸0.2‑0.8g，天冬氨酸0.2‑0.8g，缬氨酸0.2‑4.0g，琼脂粉15‑20g，水1L；pH 6.3‑6.8，121℃灭菌20‑30min，得发酵培养基；（3）接种、发酵：将步骤（2）所得发酵培养基冷却至45‑50℃，在无菌条件下将培养基倒入无菌的培养皿中，培养基厚度控制在2‑3mm；静置5‑10min，待培养基凝固后，按照0.02‑0.08mL种子液/9cm直径培养皿的接种量接入步骤（1）所得纳豆芽孢杆菌种子液，并用无菌的涂布棒将种子液在培养基表面涂布均匀；再置于28‑35℃，相对湿度70‑85%条件下发酵培养48‑96h；V₇‑surfactin的提纯步骤：（4）V₇‑surfactin的提取：发酵结束后，将体积浓度为90‑100%的甲醇按照4‑5mL甲醇/9cm直径培养皿的量喷入培养物表面，常温下浸提3‑5min；重复浸提操作2‑3次，合并各次浸提液；将浸提液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/10‑1/5，得提取浓缩液；（5）V₇‑surfactin的制备：将步骤（4）所得提取浓缩液过0.22μm或0.45μm滤膜或经固相萃取预处理，再用制备型HPLC分离。