[发明专利]一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法

摘要

本发明公开了一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法，特点是先制备可降解的交联型聚己内酯—聚乙二醇—聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜，再在此面膜上接枝丝素蛋白，然后取下咽黏膜组织培养出下咽成纤维细胞，最后在接枝有丝素蛋白的平面膜上种植原代下咽成纤维细胞，得到组织工程化的人工下咽瓣膜；优点是本方法所制得的交联型聚己内酯—聚乙二醇—聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜其力学强度好、弹性好，适合作为软组织的人工下咽瓣膜的基材，在移植到患者的咽喉部后，由于在平面膜的组成成份中含有亲水的聚乙二醇和易发生降解的己内酯而使其降解性能优于医用聚氨酯，随着新生瓣膜组织的再生，此平面膜逐渐降解；且与周围组织相亲性更好，更易融合于体内环境，符合人体的下咽组织机能的需求。

主权项

一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：（1）、将己二胺溶于正丙醇中得到浓度为0.01～0.10 g/ml 的己二胺/正丙醇溶液，将丝素蛋白溶于水中得到浓度为1～10g/L的丝素蛋白水溶液，备用；（2）、取5～10g聚乙二醇、4.5～10g ε‑己内酯，以及占两者总质量0.1～1.0%的乙酰丙酮铁，置于干燥的三口烧瓶中，在干燥的氮气保护下，在120～140℃的温度下反应18～40h，得到聚己内酯—聚乙二醇—聚己内酯三嵌段共聚物，即预聚物；（3）、在反应瓶中将4～10g上述预聚物溶于43～105g的1，4‑二氧六环中，在干燥氮气的保护下，在上述反应瓶中加入0.9～2.8g的六亚甲基二异氰酸酯形成溶液体系，向此溶液体系中加入占预聚物质量0.1～1.0%的乙酰丙酮铁，升温至70℃，反应1～3h后停止加热，待体系的温度降至室温，再往此体系中加入含0.13～0.34g三羟甲基丙烷的5毫升1，4‑二氧六环溶液，反应5～10h，移出反应瓶，在室温下成膜，得到可生物降解的交联型聚己内酯—聚乙二醇—聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；（4）、取上述平面膜，用体积分数为75%的医用酒精浸洗15～30min，室温晾干，然后将此平面膜浸入步骤（1）准备好的己二胺/正丙醇溶液中，在35℃的温度下浸泡1～2min，取出后用去离子水浸洗3次，每次5～10min，再将平面膜在质量浓度为0.5～2%的戊二醛水溶液中浸泡3～6h，取出后用去离子水浸洗3次，每次5～10min，最后将平面膜浸入步骤（1）准备好的丝素蛋白水溶液中，在4℃的温度下反应12～24h，取出后用去离子水浸洗3次，每次5～10min，37℃下真空烘干，得到表面接枝丝素蛋白的交联型聚己内酯—聚乙二醇—聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；（5）、取离体的下咽组织，用含有青霉素和链霉素的无菌PBS混合液冲洗，其中青霉素在PBS混合液中的浓度为1000U/mL，链霉素在PBS混合液中的浓度为1mg/mL，然后将下咽组织在体积分数为75%的医用酒精中浸洗5～10s，取出后用上述PBS混合液冲洗，再将下咽组织浸在1000ppm的次氯酸钠中1～2min，取出后用上述PBS混合液冲洗，然后将下咽组织切成1～3mm³的组织小块贴附于培养皿中，放置30min后，往培养皿中加入含有胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM 培养基并淹没下咽组织小块，其中：胎牛血清在DMEM 培养基中的体积分数为10%、青霉素的浓度为100U/mL、链霉素的浓度为100mg/L，1天后更换上述DMEM培养基，之后每隔2天更换DMEM培养基，约一周后在下咽组织小块的周围长出下咽成纤维细胞，待下咽成纤维细胞长至40～60%时弃去下咽组织块，继续培养下咽成纤维细胞至80%，传代，取传至3～5代的原代下咽成纤维细胞种植于步骤（4）所制得的丝素蛋白接枝的交联型聚己内酯—聚乙二醇—聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜上，悬液浓度为5×10⁴/毫升，得到组织工程化的人工下咽瓣膜。