[发明专利]人源DNA甲基化分析中重亚硫酸盐转化DNA转化效率的评估方法

摘要

本发明涉及一种人源DNA甲基化分析中重亚硫酸盐转化DNA转化效率的评估方法，该方法应用实时PCR TaqMan探针法，分别以梯度稀释的重亚硫酸盐转化和未转化DNA标准品转化与未转化的DNA的Ct值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线。使用相同的引物或探针定量检测重亚硫酸盐转化后的DNA样本从而评估转化效率。结果显示该方法可以精确评估人源样本经重亚硫酸盐转化的转化效率。使用已知转化和未转化拷贝数的混合DNA作为模板，证实了TaqMan探针法的可靠性。应用该方法评估不同商业化试剂盒转化人源DNA样本的转效率，显示该方法能够有效地评估DNA样品重亚硫酸盐的转化效率，为人源DNA甲基化准确分析提供了可靠快捷的方法。

主权项

一种人源DNA甲基化分析中重亚硫酸盐转化DNA转化效率的评估方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计并扩增DNA标准品及引物和探针：1)标准品1：是指与人源的β‑actin上游一段不包含CG位点DNA同源的序列，该序列未经重亚硫酸盐转化；2)标准品2：是指标准品1中未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶后的序列；3)引物1和探针1：是指根据标准品1的序列设计的用于扩增标准品1的检测引物和探针；4)引物2和探针2：是指根据标准品2的序列设计的用于扩增标准品2的检测引物和探针；(2)使用重亚硫酸盐转化人源的DNA，使DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(3)以未转化的任意人源DNA和相应转化的DNA的样本为模板，分别使用对应的引物1和引物2应用Taq酶进行PCR扩增并纯化分别制备标准品1和标准品2；(4)使用所述引物1和探针1以及引物2和探针2，以所述标准品1与标准品2按照梯度稀释为模板，分别做标准曲线，其中标准曲线以模板的拷贝数CN对应相应的Ct值；(5)将待测的人源的DNA样本使用重亚硫酸盐进行转化；(6)使用引物1和探针1以及引物2和探针2，以步骤(4)转化后的DNA样本为模板，分别检测转化后人源DNA样本中未转化的DNA与转化的DNA的Ct值；再根据步骤(4)中的标准曲线，计算出样本中未转化的DNA与转化的DNA相应的拷贝数；(7)使用计算公式：重亚硫酸盐转化DNA转化率(％)＝转化的DNA拷贝数/(未转化的DNA拷贝数+转化的DNA拷贝数)×100％，计算转化率。