[发明专利]一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法

摘要

本发明公开了一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点，根据马铃薯质体基因组全序列资料设计合成引物，PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因区段。将所扩增的约2.7kb的片段进行序列测定及同源性比较，将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段，构建马铃薯质体定点转化载体pBGLIA-GFP。通过基因枪轰击，该载体在马铃薯块茎中瞬时表达GFP蛋白，验证外源蛋白的表达特性，为进一步将利用马铃薯等作物器官作为生物反应器来表达外源蛋白快速生产药用蛋白，生物抗体等奠定基础。

主权项

一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取马铃薯幼嫩叶片中的总DNA；2)根据马铃薯质体基因中的trnI‑trnA基因序列设计合成了引物C1和C2；3)以供试马铃薯的总DNA为模板，用高保真DNA聚合酶扩增trnI‑trnA基因特异片段，连入pUC18载体，进行序列测定，得到阳性克隆；4)设计两对引物GLI1、GLI2和GLA1、GLA2，分别扩增阳性克隆的trnI和trnA区段；5)将所扩增的trnI区段分别用ClaI和Hind III进行消化，连接入经ClaI和Hind III内切酶消化的pBio‑3载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化菌落，获得pBMLSI‑GFP；6)用MluI和EagI消化所扩增的trnA基因区段，连入经MluI和EagI内切酶消化的pBMLSI‑gfp载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化菌落，培养后提取质粒，完成GFP基因马铃薯质体表达载体pBMLSIA‑GFP的构建。