[发明专利]一种利用硫酸寡糖组鉴别北极刺参的方法

摘要

本发明提供一种用于检测北极刺参的硫酸寡糖组合及检测方法，利用海参中对照硫酸寡糖的检测，来鉴别北极刺参，特异性好，分析准确可靠。检测方法具有简便快速，灵敏度高，分辨率高的特点。采用液相色谱‑质谱联用技术，可以一步完成海参硫酸寡糖混合物的分离和分析，质谱能够准确分辨来源于岩藻糖基硫酸软骨素和岩藻聚糖的混合硫酸寡糖，节省了硫酸寡糖的离子交换柱纯化、凝胶色谱柱分离和脱盐等步骤，大大缩短了检测时间。本方法灵敏度高，需要的样品量仅为5μg。质谱还能够检测到寡糖混合物中所有微量的寡糖，得到北极刺参的硫酸寡糖的全指纹谱图，通过对照硫酸寡糖的分析可以准确的鉴别北极海参。

主权项

一种检测北极刺参的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：1)对待测海参样品进行液相色谱‑质谱前处理，获得待测硫酸寡糖溶液；所述的液相色谱‑质谱前处理包括如下的步骤：待测海参样品粉碎成粉末状态，加入0.1mol/L的磷酸缓冲溶液、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解24h；将反应物沸水浴5min灭酶活后离心，取上清液；其中磷酸缓冲溶液的组成为pH 8.0，15mmol/L EDTA‑Na2、5mmol/L半胱氨酸；取氯化十六烷基吡啶水溶液加入上述上清液中，室温静置，离心，收集沉淀；将收集的沉淀用添加了NaCl的乙醇溶液溶解后，加入95％乙醇，4℃下放置24h，离心后，收集沉淀，完成刺参硫酸多糖的提取；将刺参硫酸多糖溶于0.5mol/L Na2HPO4溶液中，加入醋酸铜溶液和H2O2，60℃水浴降解3h；然后用NaOH调节溶液至pH 9.0，离心后，取上清液；采用1kDa的滤膜4000×g超滤10min，收集上层的滤液，完成刺参硫酸寡糖溶液的制备；2)通过液相色谱‑质谱联用法检验待测海参样品的硫酸寡糖成分，分析样品中的北极刺参成分，检测是否出现特定的硫酸寡糖组合；所述的硫酸寡糖组合，其中第一组合为(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n，其中n＝1‑4；第二组合为(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n，其中n＝2‑3；(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n，其中n＝1‑4；(GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n，其中n＝2‑6；(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n，其中n＝4‑7；所述的液相色谱‑质谱联用法检测，其色谱条件如下：色谱柱：Luna HILIC柱，流动相A：5mM醋酸铵水溶液，流动相B：乙腈，进样量为4μL，流动相A的洗脱梯度是10％‑35％，0‑40min洗脱，流速150μL/min；质谱的条件：负离子模式，电喷雾源，质量分析器为Orbitrap‑傅里叶转换，负离子模式，毛细管电压‑40V，套管透镜补偿电压‑50V，毛细管温度设为275℃，层流量为30arbitrary，辅助气体的流量6arbitrary，扫描分子量300‑1000u，Xcalibur质谱软件中处理。