[发明专利]一种快速检测沙门氏菌的方法

摘要

本发明提供了一种快速检测沙门氏菌的检测方法。方案将Fe3O4/ Ru(bqy)32+纳米微球富集细菌，制备试纸条，上样检测。免去了将沙门氏菌从免疫磁珠中洗脱下来的步骤，提高了捕获效率；免去了将Ru(bqy)32+纳米微球喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小；减少了工作量和杂菌污染概率。检测方案灵敏度非常高、稳定性很好。

主权项

一种快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于包括以下步骤：1)纳米微球的制备：a.添加0.4‑0.8mmolFeCl3·6H2O和0.2‑1.6mmol FeCl2·4H2O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80‑120℃，然后将3‑7mL 25％的NH3·H2O添加到混合液中，反应2h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe3O4纳米粒子；b.取12mg Fe3O4纳米粒子用1‑10mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3‑0.9mL的NH4OH溶液，再将10‑300μL正硅酸乙酯溶解在50μL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe3O4纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子；c.把10‑300μL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，1‑10mL去离子水和1mL 0.5‑3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)32+)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子，最后加入600‑900μL的NH4OH，剧烈搅拌3h，得到Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球，用去离子水清洗备用；d.将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球；e.将硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70℃，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球；2)取0.5‑2mg羧基化的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球加入1mL偶联缓冲液中，调节pH至5‑10，加入0.05‑0.18mg 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，及200‑600μg抗沙门氏菌单抗，在温度37℃时，放在10‑15rpm的旋转仪上偶联60‑120min，磁分离3‑5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3‑5遍之后，取1mL封闭剂与纳米微球混合封闭0.5‑1h，得到Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球‑单抗；所述偶联缓冲液配制方法如下：将3mL 19.07g/mL的硼砂与7mL 12.37g/mL的硼酸混合后，稀释10倍体积；所述清洗缓冲液配制方法如下：称取0.43g 2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的无菌蒸馏水中，调pH为5.5‑6.0；所述封闭剂配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸盐(PBS)缓冲液配成封闭剂；3)培养沙门氏菌，将菌液调整浓度为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，各取1mL备用；取待测样品溶液1mL、各浓度菌液1mL，分别与100‑150μg Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球‑单抗，于温度37℃，旋转仪转速10‑15rpm混合孵育30‑60min，孵育后磁分离3‑5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球‑单抗‑菌；4)免疫层析试纸条的制备：将样本垫用含1％BSA，0.5％Tween‑20的pH 8.50.1M Tris‑HCl缓冲液浸泡处理，置于60℃鼓风干燥箱，2h后取出备用；将沙门氏菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，浓度均为1‑2mg/mL，喷量均为0.75μL/cm，37℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡；将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用；5)试纸条对样品的检测：将收集到的Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球‑单抗‑菌稀释到50‑150μg/mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10‑15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；6)定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有沙门氏菌，T线不显色则说明样品中没有沙门氏菌或是含有沙门氏菌的量低于103CFU/mL；7)定量分析：使用荧光读取仪测量T线、C线的荧光强度，以及T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中的沙门氏菌数量。