[发明专利]一种高产脱氧雪腐镰刀菌烯醇的敲除突变体菌株的构建方法

摘要

一种高产脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单敲除突变体菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)利用split‑PCR方法，将禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成过程中的负调控因子高亲和性磷酸二酯酶基因FgPDE2从禾谷镰刀菌PH‑1的基因组中敲除，获得单敲除突变体；FgPDE2的基因及上下游序列如SEQ ID NO：1所示；(2)采用PEG‑介导的原生质体转化到禾谷镰刀菌中，然后采用抗性筛选标记筛选敲除转化子；最后以禾谷镰刀菌的基因组为参照，利用5F和6R引物验证敲除转化子的目的基因被新霉素抗性基因所替代。本发明单敲除突变体菌株产毒量大幅提高；而双敲除突变体菌株产毒量更高，且该基因改造突变体丧失了对小麦穗的侵染能力，大大降低了双敲除突变体菌株可能的扩散造成的不良后果。

主权项

1.一种高产脱氧雪腐镰刀菌烯醇的敲除突变体菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建基因敲除载体：利用split‑PCR方法，将禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成过程中的负调控因子高亲和性磷酸二酯酶基因FgPDE2从禾谷镰刀菌PH‑1的基因组中敲除，获得单敲除突变体；FgPDE2的基因及上下游序列如SEQ ID NO：1所示；（2）转化、筛选、鉴定：采用PEG‑介导的原生质体转化到禾谷镰刀菌中，然后采用抗性筛选标记筛选敲除转化子；最后以禾谷镰刀菌的基因组为参照，利用5F和6R引物验证敲除转化子的目的基因被新霉素抗性基因所替代，即成；步骤（1）中，将禾谷镰刀菌中的低亲和性磷酸二酯酶基因FgPDE1同时进行敲除，获得双敲除突变体，FgPDE1的基因及上下游序列如SEQ ID NO：2所示；所述敲除FgPDE2所用引物序列PDE1‑1F+PDE1‑2R；PDE1‑3F+PDE1‑4R；YG/F+HY/R；HYG/F+HYG/R，如SEQ ID NO：3～10所示；步骤（1）中，所述敲除FgPDE1所用引物序列PDE2‑1F+ PDE2‑2R，PDE2‑3F+ PDE2‑4R，EN/F+GE/R、GEN/F+GEN/R，如SEQ ID NO：11～18所示；步骤（2）中，所述禾谷镰刀菌为禾谷镰刀菌野生型PH‑1菌株；所述5F和6R引物为PDE2‑5F，如SEQ ID NO:19所示，PDE2‑6F，如SEQ ID NO:20所示；PDE1‑5F，如SEQ ID NO:21所示，PDE1‑6R，如SEQ ID NO:22所示；所述抗性筛选标记对于FgPDE2进行敲除，选用新霉素；对FgPDE1进行敲除，选用潮霉素。