[发明专利]一种增加有效细胞融合的方法

摘要

本发明提供一种增加有效融合细胞的方法。该方法包括(一)、测定实验动物对LPS的免疫剂量(二)、实验动物抗原免疫效果的监测(三)、LPS对达到免疫条件的实验动物进行刺激免疫。本发明人经实验统计，本发明融合方法具有明显优势，本发明方法经过3次融合共获得24株细胞株，现有技术融合只获得3株细胞株。本发明方法在筛选获得目的细胞株的概率上是常规技术的8倍。本发明取得了显著进步。本发明方法可用于抗体如单克隆抗体的筛选和融合，有利于增加分泌抗体细胞株数量；有利于建立抗体库时筛选合适抗体。体外培养生产抗体时，可以加速细胞株生长，缩短时间，降低生产成本，本发明宜于工业化生产，具有较大的应用价值。

主权项

一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：(一)、测定实验动物对LPS的免疫剂量:1)配制10mM磷酸盐缓冲液十二水合磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，溶解于1L纯化水中，在25℃下测定pH，以氢氧化钠、盐酸调pH至6.0‑9.0；2)取6支eppendorf管，编号1‑6；取LPS用PBS按照0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml稀释；3)将稀释后的溶液经0.22μm无菌滤膜过滤除菌,收集滤液；4)每只小鼠注射0.01ml‑0.2ml上述无菌滤液，计每只小鼠0‑0.8mgLPS无菌滤液，并同时3组平行试验；5)观察小鼠状态，记录各剂量试验小鼠的反应、状态，据此测定脂多糖免疫剂量；(二)、实验动物抗原免疫效果的监测：常规小鼠免疫，并在免疫后3‑5天内进行断尾采血、离心10000g、4分钟，取上清用PBS梯度稀释，进行酶联免疫吸附试验测定效价；(三)、LPS对达到免疫条件的实验动物进行刺激免疫；1)当抗原免疫效价达到500‑60万，最优选2‑10万时，进行加强免疫：取抗原5‑100μg溶解于200μl PBS中，混匀后腹腔注射10‑200μl/只；并在加强免疫的同时对小鼠注射LPS液:剂量为0.005‑0.3mg/只，观察小鼠情况；2)融合前24小时再次对小鼠注射LPS液：剂量为0.05‑0.4mg/只,优选为0.1‑0.4mg/只，最优选为0.12‑0.2mg/只；注射方法为腹腔注射或静脉穿刺，优选静脉穿刺；3)小鼠经步骤2)注射LPS液24小时后融合：Ⅰ取小鼠脾脏研磨，加含1％双抗链霉素和青霉素的DMEM培养液1000g离心7分钟，2‑3次，计数；Ⅱ取处于对数期小鼠骨髓瘤细胞，每次加含1％双抗的DMEM培养液1000g离心7分钟2‑3次，计数；Ⅲ将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞按照1:4‑1:10的比例混合，优选为1:4‑1:6的比例混合；Ⅳ将上述混合细胞离心，去上清，敲击离心管底部，使细胞成糊状；Ⅴ在5s‑90s内缓慢加入0.2‑2.0ml聚乙二醇，分子量为3000‑6000，优选为4000‑5000，并轻轻搅拌，加入PEG时间控制30‑60S，优选为40‑50s,加入PEG的量为0.5‑1.5ml，优选为0.8‑1.2ml；Ⅵ继续搅拌5‑120s，优选30‑90s，最优选为50‑70s；Ⅶ静置5‑120s，优选15‑60s,最优选为20‑40s；Ⅷ在1min内缓加DMEM,之后加快速度，使溶液体积达到10‑80ml，离心，去上清，沉淀用含2倍HAT的DMEM培养基稀释成50‑150ml，优选为70‑100ml，以每孔100μl加入到96孔板中，37℃，5％二氧化碳培养，并于第二日每孔补加含饲养细胞的DMEM培养液100μl；4)在融合后5‑15天据情况对细胞板检测，优选7‑10天检测，挑选阳性孔进行亚克隆；5)经过3‑5轮克隆直至得到全阳性细胞板，此时的细胞即为单克隆细胞。