[发明专利]一种血红蛋白类携氧纳米凝胶及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种血红蛋白类携氧纳米凝胶，它是聚乙二醇‑聚乙烯亚胺嵌段共聚物与血红蛋白的共价结合物经交联形成的纳米水凝胶，其中，血红蛋白上连接有结合珠蛋白；所述的聚乙二醇‑聚乙烯亚胺嵌段共聚物中，聚乙烯亚胺嵌段上含有接枝基团。本发明还公开了前述血红蛋白类携氧纳米凝胶的制备方法和用途。本发明血红蛋白类携氧纳米凝胶对血管内皮细胞的毒性低，可克服现有血红蛋白类携氧载体副作用强的缺陷，具有良好的应用前景和经济效益。

主权项

1.一种血红蛋白类携氧纳米凝胶的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：/n(1)纳米凝胶mPEG-PEI-g-SH的制备：/n将摩尔质量为5000g/mol的羧基聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH溶于二氯甲烷，于室温及纯度大于97％的氮气流保护条件下，加入2倍摩尔量EDC·HCl反应0.5h后，再加入1倍摩尔量NHS反应2h，将上述反应溶液匀速滴加到摩尔质量为1800g/mol的支链PEI的二氯甲烷溶液中，40℃油浴中反应6-12小时后终止反应，待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冰石油醚中沉淀，将沉淀过滤，使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到mPEG-PEI；将mPEG-PEI溶解于0.1M的NaHCO₃溶液中，所述NaHCO₃溶液中含5mM的EDTA，在纯度大于97％的氮气流保护条件下，按照摩尔比1：1-10加入Traut’s试剂，反应12-24小时后终止反应，产物经透析纯化，再冻干即可得mPEG-PEI-g-SH；所述mPEG-PEI-g-SH中-SH的接枝率为30％，分子量为6620～6840；/n(2)DBBF修饰的血红蛋白的制备：/nA、取纯化血红蛋白，加入有机磷酸盐，加入具有缓冲能力的物质，调节其pH为6.0-8.0；/nB、在低温下0℃-10℃，对血红蛋白溶液反复通氮气、抽真空的方法，进行脱氧；/nC、加入DBBF，DBBF∶Hb为2.5∶1，在通氮条件下，反应温度为35℃～40℃，pH值为6.0～8.0，反应时间2.5小时，血红蛋白溶液浓度为50mg/ml；/nD、用氨基酸中止反应，氨基酸与DBBF的摩尔比为2∶1，反应时间2小时；/n(3)血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶的制备：/n称取700mg步骤(1)所得mPEG-PEI-g-SH溶解于0.1M Tris缓冲液，经抽真空通N₂后，在氮气流下加入0.1％DTT，反应2h后，于4℃加入步骤(2)制备的DBBF修饰的血红蛋白560mg，4℃避光搅拌反应6-12h后，用磷酸盐缓冲液洗涤后经超滤离心除去游离血红蛋白，直至洗涤清液在400-600nm区域无吸收为止，将所得载血红蛋白的纳米水凝胶分散于磷酸盐缓冲液，加入200μg结合珠蛋白，4℃避光振荡反应4小时，反应产物在10000g下冷冻高速离心分离，即得。/n