[发明专利]一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用

摘要

本发明涉及一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用，所述系统包括4种酿酒酵母等位基因整合质粒分别为pDH735、pDH818、pDH824和pDH825。所述系统应用于酿酒酵母的等位基因高效整合，整合方法包括：构建4种基于不同用于酿酒酵母等位基因整合的卡盒的酿酒酵母等位基因整合质粒；将待研究的靶向基因及其侧翼克隆到质粒的整合卡盒中；将整合卡盒释放或扩增出来，转入基因敲除背景或者非基因敲除背景的酿酒酵母菌株中，筛选鉴定整合效果。本发明高效、便捷、高通量、适用范围更广的等位基因整合方法；尤其是适用于酿酒酵母基因组的快速、大通量的等位基因整合。

主权项

1.一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统，其特征在于，所述系统包括4种酿酒酵母等位基因整合质粒分别为pDH735、pDH818、pDH824和pDH825；其中，pDH735携带的整合卡盒为：pTEF‑attP1‑ccdB‑CAT‑attP2‑pTRP1‑kan‑tTEF；pDH818携带的整合卡盒为：pT‑attP1‑ccdB‑CAT‑attP2‑pTRP1‑kan‑tTEF；pDH824携带的整合卡盒为：pTEF‑attP1‑ccdB‑CAT‑attP2‑pADH1‑nat‑tTEF；pDH825携带的整合卡盒为：pT‑attP1‑ccdB‑CAT‑attP2‑pADH1‑nat‑tTEF；所述pDH735的构建方法包括：将质粒pDONR221中的attP1‑ccdB‑CAT‑attP2分成上、下游两段分别克隆到pDH734的pTEF‑pTRP1‑kan‑tTEF卡盒中，构建pTEF‑attP1‑ccdB‑CAT‑attP2‑pTRP1‑kan‑tTEF整合卡盒，所获质粒即为pDH735；所述pDH818的构建方法包括：将质粒pDH735中的attP1‑ccdB‑CAT‑attP2卡盒克隆到质粒pDH817中，构建pT‑attP1‑ccdB‑CAT‑attP2‑pTRP1‑kan‑tTEF整合卡盒，所获质粒即为pDH818；所述pDH824的构建方法包括：将质粒pDH735中的attP1‑ccdB‑CAT‑attP2卡盒克隆到质粒pDH823中，构建pTEF‑attP1‑ccdB‑CAT‑attP2‑pADH1‑nat‑tTEF整合卡盒，所获质粒即为pDH824；所述pDH825的构建方法包括：将质粒pDH818中的pT启动子及attP1‑ccdB‑CAT‑attP2克隆到pDH823中，构建pT‑attP1‑ccdB‑CAT‑attP2‑pADH1‑nat‑tTEF卡盒，所获质粒即为pDH825；其中，质粒pDH734是在pFA6a‑kanMX基础上，导入了含有EM7启动子及TRP1启动子的pTEF‑pTRP1‑kan‑tTEF卡盒；pDH817质粒是在pDH734基础上改造得到，pT启动子仅含有pDH734上pTEF的前148bp的序列；将ADH1启动子克隆到pAG25中，构建pTEF‑pADH1‑nat‑tTEF卡盒，所获质粒命名为pDH823。