[发明专利]一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用

摘要

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中以非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用。来源于瘤胃菌Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶RDPE本身不带有任何信号肽或分泌信号，却可以大量分泌到胞外；通过实验证明了RDPE并非通过Sec途径或Tat途径进行分泌，也不是因为细胞自溶和裂解而泄漏到胞外。因此，RDPE在枯草芽孢杆菌中是一种非经典分泌蛋白。将RDPE分别与18种目标蛋白进行融合，尝试以RDPE作为转运信号实现目标蛋白的分泌表达，16种融合蛋白均在胞内有明显的表达，9种融合蛋白被成功分泌到胞外，其中2种融合蛋白的分泌水平占相应融合蛋白总量的比例大于50%。所以，本实验发展了一种实现蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达的新策略。

主权项

1.一种利用非经典分泌蛋白实现目标蛋白分泌表达的方法，其特征在于：所述非经典分泌蛋白为RDPE，其是来源于瘤胃菌(Ruminococcus sp.)5_1_39B_FAA的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RDPE不含有任何经典的信号肽和分泌信号序列，该方法包括以下步骤：(1)根据Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA的DPEase编码基因rdpe序列进行全基因合成，并在该基因核苷酸序列的5’和3’端分别引入NdeI和BamHI限制性酶切位点，合成好的基因连接到pUC57载体上，获得pUC57‑RDPE；(2)将质粒pUC57‑RDPE和pMA5分别进行NdeI和BamHI双酶切处理，胶回收后得到两端分别带有NdeI和BamHI酶切位点的rdpe片段和线性化的pMA5载体，将两者以T4连接酶进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α获得pMA5‑RDPE；(3)以步骤(2)获得的质粒pMA5‑RDPE为模板，用引物对pMA5‑RDPE‑F3/pMA5‑RDPE‑R3扩增线性化的载体pMA5‑RDPE3，将PCR产物进行胶回收后以T4多聚核苷酸激酶进行处理，然后加入T4连接酶以使载体自连；将连接体系转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pMA5‑RDPEL，其中pMA5‑RDPE‑F3序列为GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC，pMA5‑RDPE‑R3序列为GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTCAAATACATGTTTTACAAAG；(4)扩增目标蛋白基因，通过胶回收获得相应的基因片段，所述目标蛋白为枯草芽孢杆菌来源的GroES、DnaK、Pel、PhoA或YwbN，或大肠杆菌来源的PhoA或地衣芽孢杆菌来源的AmyL或真核生物来源的GFP或RFP中的一种；(5)以步骤(3)获得的质粒pMA5‑RDPEL为模板，使用引物对pMA5‑RDPEL‑F/R进行PCR，通过胶回收获得线性化的载体pMA5‑RDPEL，其中pMA5‑RDPEL‑F序列为GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC，pMA5‑RDPEL‑R序列为GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTC；(6)将步骤(4)获得的目标蛋白基因片段与步骤(5)获得的线性化的载体pMA5‑RDPEL进行POE‑PCR，得到融合产物；(7)将步骤(6)获得的融合产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到对应的重组表达质粒pMA5‑RDPE‑TP，其中TP代表目标蛋白，该质粒包含组成型强启动子PHpaII，氨苄青霉素和卡那霉素抗性选择标记基因，及由RDPE的编码序列、21bp的柔性Linker序列和目标蛋白的编码序列融合而获得的DNA序列，其中21bp的柔性Linker序列为5’‑GGTAGCGGTGGAGGTGGCAGC‑3’；(8)将步骤(7)获得的重组表达质粒转化入枯草芽孢杆菌中对目标蛋白进行发酵，实现目标蛋白的分泌表达，发酵培养基为2.0％～4.0％蛋白胨、3.0％～7.0％酵母提取物和0.3％～0.9％磷酸氢二钾，pH 7.2；活化所构建重组枯草芽孢杆菌菌株，于37℃、200rpm条件下进行摇瓶发酵。