[发明专利]不同肠道病毒血清型全基因组的扩增方法

摘要

本发明公开了一种不同肠道病毒血清型全基因组的扩增方法，该方法通过提取病毒RNA，利用肠道病毒通用引物222－224对病毒RNA的VP1区进行RT-PCR、测序、比对，通过分子生物学实验技术对病毒株进行血清型定型；并设计相应引物；再利用肠道病毒5’UTR和3’UTR的保守性，设计引物，根据以上配对引物进行相应的RT-PCR扩增、测序、比对，直到获得整个基因组核苷酸序列。本发明所述方法具有扩增速度快、扩增方法简便易行等优点，可大幅度降低成本，是一种高效、快速的不同肠道病毒血清型全基因组的扩增方法。

主权项

一种不同肠道病毒血清型全基因组的扩增方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）提取病毒RNA，利用肠道病毒通用引物222－224对病毒RNA的VP1区进行RT‑PCR扩增，然后用1％的琼脂糖凝胶、电压120V进行电泳检测，检测结果与预测结果相近，对扩增所得核苷酸目的条带进行测序，并进行NCBI BLAST比对，如果该质询序列与GenBank数据库中肠道病毒参考株核苷酸序列同源性大于75%，即认为是同一血清型，同时即获得所述病毒VP1区基因的核苷酸序列；（2）利用肠道病毒5’UTR和3’UTR的保守性，针对肠道病毒全基因组设计一条首端上游引物EV1F（5’TTAAAACAGCCTGTGGGTTG 3’）和一条尾端下游引物EV8R（5’CACCGAATGCGGAGAATTTA 3’），再根据步骤（1）扩增所得所述病毒的VP1区实际核苷酸序列，设计一条所述首端上游引物EV1F的配对下游引物EV2R和一条所述尾端下游引物EV8R的配对上游引物EV3F，然后分别以EV1F‑EV2R和EV3F‑EV8R 进行RT‑PCR扩增，其产物用1％的琼脂糖凝胶，120V 进行电泳检测，紫外凝胶成像仪检测结果若有接近2400bp和5000bp的电泳条带即与预期结果相符，扩增结束，并用相对应扩增引物进行测序；（3）测序、拼接和整理  根据步骤（2）所得核苷酸序列再设计测序引物进行测序，直到获得整个基因组核苷酸序列。