[发明专利]一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒

摘要

本发明公开一种用于检测HBV‑B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法；所述试剂盒包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV‑B病毒基因阳性质控、HBV‑C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；方法包括如下步骤：1）受检样品处理；2）质控品的处理；3）配制数字PCR反应混合液；4）生成微反应液滴，并进行数字PCR反应扩增；5）读取荧光信号，分析HBV型别并计算各自拷贝数。本发明采用数字PCR技术和双色荧光探针，同时检测HBV的两个亚型，且不依赖于外来标准物及标准曲线，操作简便，可直接对HBV精准绝对定量。

主权项

1.一种用于检测HBV‑B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV‑B病毒基因阳性质控、HBV‑C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；所述数字PCR反应缓冲液A中包括有HBV‑B型的引物及探针和HBV‑C型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B中包括有内标的引物及探针；所述HBV‑B型、HBV‑C型和内标的引物及探针如下所示：HBV‑B型和HBV‑C型通用上游引物：ctagactcgtggtggacttctc；HBV‑B型和HBV‑C型通用下游引物：atgaggcatagcagcaggat；HBV‑B型探针：tcgcagtcccaaatctccagtcactc；HBV‑C型探针：tcgcagtccccaacctccaatca；内标上游引物：ctgccgttactgccctgtg；内标下游引物：ttggtctccttaaacctgtcttg；内标探针：accaccaacttcatccacgttcacc；所述HBV‑B型探针5’端荧光报告基因为FAM，HBV‑C型探针5’端荧光报告基团为VIC，内标探针5’端荧光报告基团为VIC，所有探针3’端淬灭基团均为BHQ；所述HBV‑B病毒基因阳性质控为HBV‑B的标准质粒溶液；所述HBV‑C病毒基因阳性质控为HBV‑C的标准质粒溶液；所述阴性质控为灭菌生理盐水；所述内标溶液为β‑globin的标准质粒溶液；所述试剂盒具体使用方法包括如下步骤：（1）受检样品处理：将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100 ~ 105℃恒温处理10 ~ 16分钟，再于12,000 ~ 14,000rpm/min离心5 ~ 10分钟，取上清液，获得PCR扩增样品DNA模板；（2）质控品的处理：分别取所述试剂盒中的HBV‑B病毒基因阳性质控、HBV‑C病毒基因阳性质控和阴性质控，按照与步骤（1）相同的方法处理，分别得到HBV‑B病毒基因阳性质控、HBV‑C病毒基因阳性质控和阴性质控的DNA模板；（3）配制数字PCR反应混合液：向步骤（1）和步骤（2）处理后得到的样品DNA模板、HBV‑B病毒基因阳性质控DNA模板、HBV‑C病毒基因阳性质控DNA模板和阴性质控DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、HBV‑B病毒基因阳性质控、HBV‑C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别采用数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制；（4）将步骤（3）制备的样品、HBV‑B病毒基因阳性质控、HBV‑C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10,000 ~ 20,000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；（5）读取荧光信号：步骤（4）PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，分别在FAM和/或VIC通道中进行HBV‑B和/或HBV‑C的分型检测，通过Quanta soft软件进行定量分析，计算出HBV‑B型和/或HBV‑C型的拷贝数。