[发明专利]一种非诊断目的微生物定性与定量的检测方法

摘要

本发明公开了一种非诊断目的微生物定性与定量的检测方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物；设计目标微生物类群与目标微生物的特征区域；设计特征区域的多重扩增引物；在待测样品中加入参考微生物与外源核酸后，提取待测样品中的微生物的核酸；利用设计的多重引物扩增微生物核酸，扩增获得特征测序片段；利用特征测序片段定性、定量分析待测样品中微生物。本发明不需要对微生物进行预培养与增殖，可以一次性地对待测样品中的多种已知微生物进行高通量、高准确度、高分辨率的检测，检测过程简单、快速且流程规范。

主权项

1.一种非诊断目的微生物定性与定量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：/n确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物；/n根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；/n制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；/n向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；/n提取所述混合样品的核酸；/n利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物；/n利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；/n根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和定量分析，/n所述目标微生物类群和所述目标微生物的定性分析方法如下：/n将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对，当差异碱基数≤n1时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征区域，其中，n1为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容错碱基数；若比对成功的所述目标微生物类群的特征区域≥1种时，则判断所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征测序片段；/n将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区域进行比对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生物的标准基因型；在所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微生物的标准基因型所对应的碱基，组成所述目标微生物的测试基因型；若所述目标微生物的测试基因型与所述目标微生物的标准基因型的差异碱基数≤n2，其中，n2为所述目标微生物的特征测序片段的最大容错碱基数，则所述目标微生物的测试基因型所在的所述高通量测序片段为所述目标微生物的特征测序片段；/n将所述参考微生物作为仅包含一个所述目标微生物的所述目标微生物类群，计算获得的所述目标微生物的特征测序片段，即为所述参考微生物的特征测序片段；/n若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5≥α5，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物类群，其中，α5为概率保障；若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5<α5，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物类群；/n若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6≥α6，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物，其中，α6为概率保障；若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6<α6，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物；/nn1使得P1≤α1且P3≤α3，其中，P1为一条不是所述目标微生物类群的特征测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阳性的概率；P3为一条所述目标微生物类群的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阴性的概率；α1和α3为判断阈值；/nn2使得P2≤α2且P4≤α4，其中，P2为一条不是所述目标微生物的特征测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物的特征测序片段而产生的假阳性的概率；P4为一条所述目标微生物的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物的特征测序片段而产生的假阴性的概率；α2和α4为判断阈值；/nP5＝1-BINOM.DIST(S1,S1,P1,FALSE)，P6＝1-BINOM.DIST(S3,S3,P2,FALSE)，S1为所有的所述目标微生物类群的特征区域的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量的中位数；S3为所有的所述目标微生物的特征区域的所述目标微生物的特征测序片段的数量的中位数，FALSE为参数值；BINOM.DIST函数返回一元二项式分布的概率；/n所述目标微生物类群和所述目标微生物的定量分析方法如下：/n所述目标微生物类群的量M1＝Mr×S1/S2，所述目标微生物类群的量的置信区间为[M11，M12]，其中，Mr为加入所述待测样品中的所述参考微生物的量；S2为所有的所述参考微生物的特征区域的所述参考微生物的特征测序片段的数量的中位数；M11和M12分别为M1值的置信区间的下限与上限；/n所述目标微生物的量M2＝M1×S3/S1，所述目标微生物的量的置信区间为[M21，M22]，M21和M22分别为M2值的置信区间的下限与上限；/nM11＝M1×(1-S4/S1)，M12＝M1×(1+S5/S1)，M21＝M2×(1-S6/S3)，M22＝M2×(1+S7/S3)；其中，S4为假阳性的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量且S4＝CRITBINOM(nS,P1,α9)，其中，nS为计算S1的所述目标微生物类群的特征区域的所述多重扩增引物所扩增的所述非特征区域的所述高通量测序片段的数量；S5为假阴性的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量且S5＝CRITBINOM(S1,P3,α9)，其中，α9为概率保障；S6为假阳性的所述目标微生物的特征测序片段的数量且S6＝CRITBINOM(S1,P2,α10)，S7为假阴性的所述目标微生物的特征测序片段的数量且S7＝CRITBINOM(S3,P4,α10)，其中，α10为概率保障；CRITBINOM函数返回使累积二项式分布大于等于临界值的最小值；/n所述目标微生物类群的特征区域为所述目标微生物类群内的微生物的参考基因组上的核酸序列；所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述参考基因组中为单一序列；所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述目标微生物类群内不同微生物间保守；所述目标微生物类群的特征区域的区分度≥3；/n所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源；所述目标微生物的特征区域的m2值≥2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群内除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基数的最小值；/n所述参考微生物的特征区域为所述参考微生物的参考基因组上的核酸序列；所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在所述参考微生物的参考基因组中为单一序列；所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在除所述参考微生物外的其它生物中不具有同源性。/n