[发明专利]一种利用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶制备L-叔亮氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶制备L‑叔亮氨酸的方法，属于酶工程和手性医药中间体制备技术领域。本发明方法包括向反应体系中添加底物三甲基丙酮酸，葡萄糖，调节体系的pH值在8.0‑9.0，加入经过外加烟酸等物质的培养基培养过的共表达菌株破碎的粗酶液(包含亮氨酸脱氢酶，葡萄糖脱氢酶及辅酶)之后开始反应，通过控制反应过程的温度在25‑30℃，pH值在8.0‑9.0，生产L‑叔亮氨酸。本发明通过采用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶体系，利用菌体自身含有的辅酶，进行L‑叔亮氨酸制备，具有单批次反应底物浓度高，反应效率高，不需要辅酶添加等特点。

主权项

1.一种制备L‑叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述方法是在含有葡萄糖、底物三甲基丙酮酸反应体系中添加共表达亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的重组菌的粗酶液，搅拌反应；所述粗酶液的制备：(1)构建共表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1的亮氨酸脱氢酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.2的葡萄糖脱氢酶的重组菌；(2)对重组菌进行培养，并诱导菌株表达亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶；(3)将发酵液离心取细胞、洗涤，然后超声破碎，即得粗酶液；所述步骤(1)是：在葡萄糖脱氢酶GDH和亮氨酸脱氢酶LDH之间加入序列如SEQ ID NO.3所示的SD‑AS序列得到基因GDH‑SD‑AS‑LDH，然后连接到pET28a质粒上，再转化到大肠杆菌BL21宿主中，得到重组菌。