[发明专利]一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体的制备方法及其应用有效
| 申请号： | 201610067928.0 | 申请日： | 2016-01-29 |
| 公开（公告）号： | CN105754990A | 公开（公告）日： | 2016-07-13 |
| 发明（设计）人： | 杨世成 | 申请（专利权）人： | 深圳精准医疗科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12N15/13;C12N5/10;C12N15/867;C12N15/66;C07K16/46;A61K39/395;A61P35/00 |
| 代理公司： | 上海申新律师事务所 31272 | 代理人： | 竺路玲 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市南山区科园*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种PD‑1/CTLA‑4双特异性抗体的制备方法及其应用。本发明通过基因工程技术以单链抗体基因为模板，以特定的高效扩增引物，通过PCR和Overlap PCR，并向抗体的可变区引入二硫键制备PD‑1/CTLA‑4双特异性抗体片段，并将该基因片段克隆到慢病毒表达载体，通过转染293T细胞进行病毒包装；然后进行CIK细胞的转导，从健康人外周血分离PBMC，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长，慢病毒与T细胞共培养，得到能够阻断肿瘤及肿瘤微环境来源的免疫抑制信号，同时增强杀伤癌细胞的功能的新型抗肿瘤T细胞。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 pd ctla 特异性 抗体 制备 方法 及其 应用 | ||
【主权项】：
一种PD‑1/CTLA‑4双特异性抗体基因片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，以抗PD‑1 dsFv基因为模板，扩增基因片段PD‑1 VH‑GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示；步骤二，以抗CTLA‑4 dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS‑CTLA‑4 VL，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.4所示；步骤三，Overlap PCR拼接步骤一和步骤二所得基因片段PD‑1 VH‑GGGGS和GGGGS‑CTLA‑4 VL，构建基因片段PD‑1 VH‑GGGGS‑CTLA‑4 VL，扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.5所示；步骤四，以抗CTLA‑4 dsFv基因为模板，扩增基因片段CTLA‑4 VH‑GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.6和SEQ NO.2所示；步骤五，以抗PD‑1 dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS‑PD‑1 VL，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.8所示；步骤六，Overlap PCR拼接步骤四和步骤五所得基因片段CTLA‑4 VH‑GGGGS和PD‑1 VL‑GGGGS，构建基因片段CTLA‑4 VH‑GGGGS‑PD‑1 VL，扩增引物序列如SEQ NO.7和SEQ NO.8所示；步骤七，Overlap PCR拼接步骤三和步骤六所得基因片段PD‑1 VH‑GGGGS‑CTLA‑4 VL和CTLA‑4 VH‑GGGGS‑PD‑1 VL，构建基因片段PD‑1 VH‑GGGGS‑CTLA‑4 VL‑furin‑GSGS‑2A‑CTLA‑4 VH‑GGGGS‑PD‑1 VL，即得到PD‑1/CTLA‑4双特异性抗体基因片段，其中，2A选自具有自剪切功能的F2A、E2A或T2A。
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