[发明专利]一株低毒力重组猪脑心肌炎病毒及其应用

摘要

本发明属于微生物动物疫苗技术领域，尤其涉及一株低毒力猪源脑心肌炎病毒,将猪脑心肌炎病毒毒株的全长cDNA置于CMV启动子控制下，采用DNA转染系统拯救病毒，获得重组病毒，方法简便易行，成功建立该病毒cDNA感染性克隆，拯救获得病毒，体外复制特性与原始病毒相似，但对小鼠致病性明显减弱，为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础；本申请得到的低毒力猪源脑心肌炎病毒经灭活后制备成疫苗，保护率高达90%，是一种安全且保护率高的灭活疫苗。

主权项

一株低毒力重组猪源脑心肌炎病毒，是通过以下步骤构建得到的：（1）提取猪源脑心肌炎病毒株总RNA，RT‑PCT扩增目的基因片段，扩增用引物如下AF5‑GCGTTAATTAAACCGTCTTGAAAGCCGGGGGTGGGAGATC‑3 AR5‑TCAGCTAGCAATGGAAGCATATTAG‑3B₁F5‑GCGTTAATTAACATTGCTAGCTGATCAAAATACAGAAG‑3B₁R5‑CACAAAGTCAGCAGTTGCGTCTGCGT‑3B₂F5‑GAAAACGCAGACGCAACTGCTGACTTTGTG‑3B₂R5‑TCTCTCGAGAGCACCCTGTGGCTCAAAG‑3CR₁5‑ TTCGGCTTGGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTT‑3CR₂5‑CTCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGTAATTCGGCTTGGGATTT‑3以猪源脑心肌炎病毒总RNA作为模板，以AR、B₁R、B₂R、以及CR₁为特异性下游引物，构建反应体系获得的A、B₁、B₂、C片段的cDNA，分别以AF/AR，B₁F/B₁R，B₂F/B₂R，CF/CR₂为引物，相应的cDNA为模板进行PCR反应，获得A、B₁、B₂、C四个片段，然后利用B₁F/B₂R为引物，将B₁和B₂片段进行融合反应，获得B片段；（2）将A、B、C片段分别与pEasy‑simple Blunt 克隆载体进行连接，转化感受态细胞，培养，提取阳性重组质粒，分别得到重组质粒pEasy‑A、pEasy‑B和pEasy‑C；（3）利用双酶切的方法将C 、B、A片段依次克隆至载体中，构建病毒全长cDNA克隆，得重组质粒pCMV‑NJ08；（4）将重组质粒pCMV‑NJ08转染BHK‑21细胞，经过培养得到猪源脑心肌炎病毒株感染性克隆rNJ08。