[发明专利]一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法

摘要

本发明公开一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，具有高生长速率的微藻隐甲藻ATCC 30556基因删除突变株的方法。其特征是包含如下步骤：(1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5‑二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco基因的克隆；(2)用于同源双交换整合的基因片段的构建；(3)Rubisco基因的删除和突变株的构建；(4)隐甲藻Rubisco基因删除突变体生长特性的比较分析。利用本发明的方法定点敲除隐甲藻的Rubisco基因，能够获得异养培养条件下具有高生长速率的隐甲藻突变株，为二十二碳六烯酸(DHA)高效发酵菌种的优化筛选提供了一种新方法。

主权项

1.一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，其特征是包含如下步骤：1） 隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5‑二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco的克隆：采用NCBI数据库中的登记号为EB086308.1的隐甲藻Rubisco序列设计上游引物和下游引物，以隐甲藻的cDNA为模板进行PCR，纯化目的片段，连入pTZ57R/T载体并测序；2）用于同源双交换整合的基因片段的构建：① 隐甲藻Rubisco基因上游片段的扩增：利用隐甲藻基因组为模板，以Rubisco基因上游片段的上游引物、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；② 隐甲藻Rubisco基因下游片段的扩增：利用隐甲藻基因组为模板，以Rubisco基因下游片段的上游引物、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；③ 潮霉素抗性基因片段的扩增：以pCAMBIA1301植物表达载体为模板，hpt上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；④用于同源双交换删除Rubisco基因的DNA片段的构建：以隐甲藻Rubisco基因上游片段、隐甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有hpt基因的DNA片段模板，进行融合PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段；3）Rubisco基因的的删除和突变株的构建：① 隐甲藻感受态细胞的制备：取隐甲藻悬浮培养48 h的细胞10 mL，4 °C, 3500 rpm离心5 min，弃上清，加入1 mL 25 mM DTT溶液，30 °C水浴15 min，离心5 min，弃上清，10 mL 1 M 山梨糖醇（sorbitol）清洗细胞三次，1 mL 山梨糖醇重悬细胞备用；② 隐甲藻感受态细胞的转化：在无菌条件下取200 μL 隐甲藻感受态细胞置于2 mm电极杯中，加入1 μL 鲑鱼精DNA和2 μg 目的片段混匀，冰浴5 min，电击转化条件为2.0 kV，电阻200 Ω，电容25 μF，电击之后冰浴5 min，加入2 mL新鲜液体C9N2培养基，25 °C，180 rpm震荡复苏48 h，取50 μL细胞悬浮液均匀涂布在含有40 mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养，并进行突变体鉴定；4) 删除突变体的分子生物学鉴定：分别提取野生型和突变株隐甲藻细胞的基因组，以hpt基因上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；5) 删除突变体的生长特性分析：在C27N7.5的液体培养基中培养，摇床设置参数为转速180 rpm，温度25 °C；步骤为：接种时取OD_490 nm为0.8的新鲜细胞5 mL加入20 mL培养基中，每组做三个平行样，用UV‑1750分光光度计测定波长为490 nm下的吸光值，每12 h测量一次，绘制柱状图；可以观察到在液体培养基C27N7.5中，突变株的生长速率比野生株要快；所述步骤2）中④所述获得目的片段是指上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段的一个完整融合PCR产物；所述步骤3）中②所述新鲜液体C9N2培养基是由葡萄糖9 g、酵母浸粉2 g、海盐25 g，加水至1 L而成；所述步骤3）中②所述含有40 mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基是由葡萄糖9 g、酵母浸粉2 g、海盐25 g、琼脂粉15 g，加水至1 L而成；所述步骤5）中所述C27N7.5液体培养基是由葡萄糖27 g、酵母浸粉7.5 g、海盐25 g，加水至1 L而成。