[发明专利]一种提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法

摘要

本发明公开了一种提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法，首先，同时应用溶菌酶法与超声波法，使鱼类肠道各类群微生物适当破壁。超声波物理破壁的条件为150‑250w，超声2‑3s，间隔5s，循环50‑60次。其次，将超声波处理后的样品与溶菌酶在55‑65℃温度的水浴恒温振荡器中共同孵育30min，与RNase A共同孵育的温度为27‑32℃。此方法利用恰当的温和超声波条件使各种微生物适当破壁，避免基因组DNA断裂降解。通过设置溶菌酶、RNase A与样品孵育的特定温度范围，即可以提高溶菌酶的裂解效果，又可避免组织和细胞中DNA酶降解基因组DNA。操作简单、提取的基因组DNA完整、降解率低，根据提取的DNA所鉴定出的微生物种类能够真实反映鱼类肠道微生物组成结构。

主权项

1.一种提取鱼类肠道微生物基因组DNA的高温复合法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取健康鱼肠道，无菌棉线结扎肠两端，无菌PBS缓冲液冲洗肠道壁上的血液、脂肪，挤压出肠道内含物，将肠道纵向剖开，刮取肠黏膜至肠道壁半透明状，将肠道壁剪成段；将肠内含物、黏膜及肠道壁碎块置于含PBS的离心管中，悬浮震荡3次，每次30s；随后4℃，800r/min，离心5min，取上清；4℃，5000r/min离心5min；弃上清，加入1.5ml PBS反复吹打，悬浮沉淀，得到菌液；(2)将含有1.5ml菌液的2ml离心管插入装有碎冰的烧杯内，使超声波细胞破碎仪变幅杆置于菌液中，在150‑250w条件下，超声2‑3s，间隔5s，循环50‑60次，以破裂微生物细胞，随后将菌液在4℃，10000‑14000r/min，离心5min，收集沉淀；(3)向沉淀中加入50μl的20mg/ml溶菌酶及750μl的1×TE缓冲液，移液枪反复轻柔吹打，重悬沉淀，在水浴恒温振荡器中，55‑65℃条件下温育30min；冷却至室温，加入10μl的20μg/ml RNase A，在水浴锅中27‑32℃温育30min；加入100μl浓度为100μg/ml的SDS、30μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K，在65℃水浴恒温振荡器中往复式震荡2h；(4)加入1ml苯酚‑氯仿‑异戊醇混合液，苯酚‑氯仿‑异戊醇混合液按体积比苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，颠倒混匀，在10000‑14000r/min条件下离心2min，取800μl上清，移至新的离心管；随后加入800μl氯仿‑异戊醇混合液，氯仿‑异戊醇混合液按体积比氯仿：异戊醇＝24：1，颠倒混匀，在10000‑14000r/min条件下离心5min，取600μl上清，移至新的离心管；加入60μl的3M NaAc和1.2ml在‑20℃预冷的无水乙醇，置于‑20℃冰箱中沉淀DNA 30min；10000‑14000r/min，离心5min，收集沉淀；(5)用体积百分比浓度75％乙醇洗涤沉淀2次，吸出剩余酒精，室温晾干，加入30‑50μl在50℃预热的1×TE缓冲液，溶解DNA。