[发明专利]高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法

摘要

本发明公开了一种高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法。狗牙根的遗传转化非常困难，严重制约了其基因功能研究和分子育种工作的开展。本发明公开的新方法利用农杆菌介导的水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体特异性地下调狗牙根内源基因的表达，为研究狗牙根的基因功能提供了高效快捷的技术手段。所述方法包括以下步骤：1）狗牙根目的基因片段的克隆；2）病毒诱导基因沉默载体的构建；3）农杆菌浸染狗牙根植株；4）基因表达丰度的分子检测。使用本方法可以成功使狗牙根内源基因的表达降低50%以上。

主权项

1.一种高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法，其特征在于，所述的狗牙根内源基因cDNA全长序列如序列表的序列2所示，编码区为序列表中序列2自5’末端第69-1757位核苷酸；/n所述的方法包括以下步骤：/n(1)狗牙根目的基因片段的克隆：提取狗牙根RNA，逆转录成cDNA，通过PCR扩增获得目的基因序列，测序确认PCR扩增结果正确性，所述克隆扩增的目的基因片段是狗牙根CdPDS基因编码区456-875核苷酸区段；所述的狗牙根目的基因片段的长度为420bp；/n(2)病毒诱导基因沉默载体的构建：将狗牙根目的基因片段和水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体进行酶切、连接、转化大肠杆菌，获得连入狗牙根目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体，挑取克隆、提取质粒、酶切验证克隆正确性；/n(3)农杆菌浸染狗牙根植株：将连入狗牙根目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体转化农杆菌，将农杆菌扩大培养，使用浸染缓冲液重悬，真空辅助浸染狗牙根植株；/n(4)基因表达丰度的分子检测：提取对照狗牙根植株和农杆菌浸染植株RNA，逆转录成cDNA，使用定量PCR检测目的基因的表达丰度变化，所述农杆菌浸染植株为真空辅助浸染后于28℃、16小时光照/8小时黑暗培养条件下继续培养21天的狗牙根植株，对照植株为28℃、16小时光照/8小时黑暗培养条件下生长28天的狗牙根植株。/n