[发明专利]基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法

摘要

本发明公开了一种基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法，体外成功培养出阴道平滑肌细胞，倒置显微镜下，可见培养的阴道平滑肌细胞呈现长梭状，细胞集结于培养皿上形成典型的“峰和谷”样构型。黏膜下层无细胞基质外观呈白色，半透明，有一定韧性。苏木精-伊红染色未见细胞成分存在。阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片苏木精-伊红染色后，光镜下可见细胞成分逐渐增多，由表浅向深层部位生长。阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片采用抗兔平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色后，均可见抗兔α-Actin的阳性细胞。结果初步证明了猪小肠黏膜下层基质可作为一种平滑肌细胞载体。

主权项

一种基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法，包括以下步骤：1）SIS制备：物理方法处理：小肠取自体质量>200 kg的家猪；在运输过程中将小肠冰冻冷藏，在4 h内完成清洁过程；用裹有纱布的刀柄去除小肠的浆膜层和肌层，其间持续用40 ℃温水冲洗；化学方法处理：沿纵轴切开经物理方法处理的小肠，切成每段15 cm长，按Abraham方法制备；化学方法处理过程的每一步均在室温下进行，材料与溶液积的比例都保持在1：100；2）阴道平滑肌细胞的分离培养：取材、分离：选取2.0~2.5 kg雌兔，氯胺酮25 mg/kg肌注麻醉后，固定四肢，充分暴露泄殖孔；下腹部及外阴部用碘伏消毒，阴道用无菌甲硝唑液冲洗；在耻骨联合上方，沿腹白线做5 cm左右切口，依次切开皮肤、腹直肌和腹膜，提起阴道，可见与双子宫相连的阴道组织，完整切取阴道组织后，缝合创口，逐层关腹；用无菌生理盐水、双抗液多次冲洗取下的阴道组织，之后将标本放入预先备好的PBS+双抗液中，送往实验室；在超净工作台上将阴道组织块浸泡于0.05%洗必泰中5 min，再用DMEM湿润组织块，用刀片和眼科手术器械仔细分离去除黏膜上皮层和浆膜结缔组织层，然后将分离好的平滑肌组织平铺修剪形成1 mm³的组织块，并使组织块边缘整齐、光滑；3）原代培养：组织块+酶消化法进行原代培养；将修剪好的组织块用0.1%胶原酶Ⅳ在37 ℃培养箱中消化0.5~1.0 h，至组织块边缘变毛时中止消化，然后将消化好的组织块接种于培养皿上，间隔约5 mm，37 ℃恒温培养箱中静置培养3.0~4.0 h，待组织块贴壁牢固后，再补加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃恒温静置培养3.0~4.0 d，待细胞游出后换液，每周换液两三次以维持细胞生长；4）阴道平滑肌细胞在SIS上种植：待细胞生长达80%融合时即进行传代，弃去旧培养基，向培养瓶加入混合消化液，37 ℃孵育3‑7 min，观察到细胞间隙增大、细胞呈圆形、部分悬浮于消化液中时向培养皿内加入体积分数为0.8%的胎牛血清终止消化，将细胞悬液离心5 min，离心收集细胞，培养基再悬浮，以5.0×106/cm²接种到SIS基质内面上，37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱内静置培养；培养基仍是含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，每隔2 d更换培养基一次。