[发明专利]一种通过表面展示实现人源精氨酸酶‑1固定化的方法

摘要

本发明提出了一种通过表面展示实现人源精氨酸酶‑1固定化的方法。步骤为设计在冰核形成蛋白剪切变体(InaK‑N)的氨基端加入信号肽和带电荷多肽，在羧基端融合人源精氨酸酶‑1，在羧基端设计HA标签；构建各种重组质粒分别转化大肠杆菌感受态细胞，获得不同基因工程菌株；将不同菌株摇瓶培养；检测人源精氨酸酶‑1展示效率和酶活；挑取酶活最高的菌株大量培养，高效转化L‑精氨酸，合成L‑鸟氨酸。本发明通过冰核形成蛋白剪切变体融合人源精氨酸酶‑1在大肠杆菌细胞表面有效展示，从而实现了人源精氨酸酶‑1固定化。与原始的冰核形成蛋白展示系统相比，明显提高人源精氨酸酶‑1展示效率和酶活，与几丁质固定化法相比，降低成本，缩短流程，简化纯化步骤。

主权项

一种通过表面展示实现人源精氨酸酶‑1固定化的方法，其特征在于：1)首先，设计携带编码带电荷多肽6×Lys或6×Glu的序列的PCR引物，通过PCR将其融合在冰核形成蛋白剪切变体InaK‑N的氨基端，设计携带编码标签蛋白HA的序列的PCR引物，通过PCR将其融合在人源精氨酸酶‑1的羧基端，然后将两类基因片段通过PCR融合在一起，构建出含有基因K6‑InaK‑N‑ARG1‑HA或E6‑InaK‑N‑ARG1‑HA的重组表达质粒；2)将构建好的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue感受态细胞，37℃静置培养过夜，获得基因工程菌株；3)将基因工程菌株，接种于LB培养基中诱导培养，此菌株经荧光抗体标记后，用流式细胞术分析不同的带电荷多肽对冰核形成蛋白展示人源精氨酸酶‑1的效率的影响；用Chinard反应检测L‑Ornithine含量，进而分析不同的带电荷多肽对冰核形成蛋白展示人源精氨酸酶‑1催化转化L‑Arg合成L‑Orn酶活的影响；4)经过测量后，选出转化L‑Arg合成L‑Orn的酶活最高的基因工程菌株，大规模培养，菌体经收集，洗涤去掉残存的培养基成分，重悬于碳酸氢盐缓冲液，以L‑Arg作为底物，转化合成L‑Orn。