[发明专利]琼脂包埋果蝇的透射电镜制样方法

摘要

本发明提供了琼脂包埋果蝇的透射电镜制样方法。该方法通过用质量分数2％的琼脂粉溶液包埋住去头的果蝇，根据果蝇的身体用双面刀片将凝固的琼脂块修整成长方体，大小为果蝇的三倍，果蝇背部贴近长方体最小面积的一面，且与之平行；锇酸再次固定；梯度乙醇-丙酮脱水、包埋剂浸透；包埋时，果蝇背部紧贴且平行的面顶在包埋板模块的最前端；聚合后切2μm的半薄切片，质量分数1％的甲苯胺蓝染色，得到果蝇背部肌肉的纵切面，实现目标位置的定位。本发明通过使用琼脂包埋去头果蝇来完成果蝇背部肌肉纵向切面的定位方法，比常规电镜处理方法更简单、准确，可广泛应用于电镜技术领域需要特定位置定位的任何样本。

主权项

琼脂包埋果蝇的透射电镜制样方法，是将果蝇用琼脂溶液预包埋后制备透射电镜样本以实现快速定位果蝇背部肌肉的方法，其特征在于：操作步骤如下：(1)果蝇经乙醚熏晕后取出，用双面刀片快速将头切下(勿人为撕断下头部)，立即将果蝇丢入体积分数为3％的戊二醛固定液中，抽真空使其沉入管底，在4℃条件下固定2小时；(2)提前配好质量分数为2％的琼脂粉溶液，放入4℃冰箱保存，用时微波炉加热溶解，温度降至不烫手时待用，取出一个载玻片，用镊子轻轻夹出步骤(1)固定液中的果蝇，放在载玻片上，调整方向为侧躺状态，在果蝇上滴两三滴琼脂溶液，待琼脂凝固后用双面刀片修整，根据果蝇身体将琼脂块修成长方体，长方体大小为果蝇体积的三倍，果蝇背部贴在长方体最小面积的一个面上，且与之平行，果蝇背部与长方体琼脂块最小面的距离为0～5毫米；(3)将步骤(2)琼脂包埋好的果蝇依次经过0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次，每次清洗10分钟；用质量分数为1％的锇酸固定2小时；用体积分数为50％、70％、90％的乙醇梯度脱水，各1次，时间各为10分钟；用体积分数90％的乙醇与体积分数90％的丙酮体积比1:1脱水10分钟；用纯丙酮脱水3次，时间各为10分钟；用环氧树脂618包埋剂与纯丙酮体积比1:1渗透1小时，用环氧树脂618包埋剂与纯丙酮体积比3:1渗透3小时；用纯包埋剂渗透过夜；纯包埋剂包埋，包埋时，将果蝇背部所平行的一面顶在包埋板模块的顶端，即果蝇背部与包埋板模块的顶端面平行；在聚合箱内36℃条件下渗透24小时，45℃条件下聚合12小时，65℃条件下聚合48小时得到琼脂包埋果蝇的透射电镜包埋块；所述包埋剂：环氧树脂618包埋剂配方：聚合条件：在36℃条件下渗透12～24小时，在45℃条件下聚合12～48小时，在65℃条件下聚合24～48小时；Epon‑812包埋剂配方：聚合条件：在60℃条件下聚合24小时；Spurr树脂包埋剂配方：聚合条件：在70℃条件下聚合12小时；(4)从步骤(3)得到琼脂包埋果蝇的透射电镜包埋块，我们发现果蝇的位置跟树脂包埋时摆放的位置一致，即背部紧贴在包埋块顶端或与顶端平行。切片机切出2μm厚度的半薄切片，在洁净的载玻片上滴一滴双蒸水，用镊子小心地将半薄切片夹到水滴上，置于电加热板上加热烤干，再滴上一滴质量分数为1％的甲苯胺蓝染液，染色30秒，双蒸水冲洗，电加热板上烤干，显微镜下观察，获得果蝇背部肌肉的纵向切面，完成定位，为该纵向肌肉位置的超薄切片做好准备。