[发明专利]一种启动子批量捕获方法

摘要

本发明提供一种启动子批量捕获方法，所述方法利用植物基因转录时在启动子区域所形成的“DNA‑蛋白因子”的复合体，应用改进的染色体免疫共沉淀技术，把包含有未知植物基因启动子片段的DNA分拣出来。本发明利用蛋白因子OsTBP2和OsTFIIB紧密结合启动子上的TATA盒短链保守序列启动转录这一特性，通过生成这两种因子的特异性抗体，结合染色质免疫共沉淀技术(ChIP)，专向捕捉未知植物基因启动子片段的技术。本技术利用大多数启动子都含有的一段TATA盒短链保守序列这一特点，结合近年来新开发的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)来分离未知的植物基因启动子片段的技术，比较容易实现植物启动子的大规模捕获，具有较高的商业价值。

主权项

1.一种启动子批量捕获方法，其特征在于，所述方法利用植物基因转录时在启动子区域所形成的“DNA‑蛋白因子”的复合体，应用改进的染色体免疫共沉淀技术ChIP，把包含有未知植物基因启动子片段的DNA分拣出来，实现启动子片段的有效富集，所述方法包括下述步骤：1)取预定量水稻材料，对水稻材料中的植物细胞进行交联；2)对所述植物细胞进行粉碎；3)对所得产物进行离心沉积，获得含有“DNA‑蛋白因子”复合体的清液，所述蛋白因子包括OsTBP2及增强OsTBP2与TATA盒结合的OsTFIIB蛋白；4)制备用于克隆OsTBP2和OsTFIIB的引物；以水稻品种日本晴的cDNA序列为模板，利用所述引物，用DNA聚合酶对OsTBP2和OsTFIIB的编码序列进行扩增，并且将该扩增片段链接在TA载体Invitrogen上，将链接有基因片段的载体转化到大肠杆菌XL‑Blue感受态细胞中，实现基因的克隆；将正确克隆的基因片段再引入到pET30a载体上，随后转化进入大肠杆菌BL2(DE3)感受态细胞中，通过1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导表达，获得OsTBP2和OsTFIIB的重组蛋白；利用OsTBP2和OsTFIIB重组蛋白生产相应抗体，对所获得的抗体进行亲和纯化，将含有“DNA‑蛋白因子”复合体的清液与所述蛋白因子的蛋白因子抗体接触，使所述蛋白因子与蛋白因子抗体相结合形成目标蛋白核酸结合体，用磁珠蛋白A收集结合有抗体的复合体，然后用10mg/ml蛋白酶K降解结合蛋白，释放出含有TATA盒的DNA片段；用水稻pal基因启动子作为模板通过半定量PCR来检测释放出的DNA片段中TATA盒的存在；5)收集所述目标蛋白核酸结合体并对所述目标蛋白核酸结合体进行酶解，除去所述蛋白因子抗体；6)从酶解产物中提取出所述DNA碎片；7)对上述释放出的DNA片段进行测序和生物信息学比对，初步确定启动子片段的富集程度；8)通过实验验证富集的启动子片段的功能，以及在其基础上进行启动子优化设计，其中，所述步骤1)包括：采用1％多聚甲醛溶液对生长10天左右的水稻幼苗进行固定，用超声波细胞破碎仪对幼苗提取液作破碎处理，交联植物细胞；所述步骤2)包括：对待提取植株材料进行超声粉碎；所述步骤7)包括对所获得的DNA碎片进行定量或半定量PCR扩增；对所获得的DNA片段进行Chip‑seq测序，通过对测序结果的生物学分析，筛选出其中可能的启动子片段；步骤8)包括：从水稻基因组中克隆出启动子片段，构建启动子与报告基因的融合表达载体，在烟草中进行瞬时转化或水稻中的稳定遗传转化，通过检测报告基因的表达模式，进一步确定分离的启动子的功能。