[发明专利]一种高效定点转基因的工具及其应用有效
| 申请号： | 201610104256.6 | 申请日： | 2016-02-24 |
| 公开（公告）号： | CN105646719B | 公开（公告）日： | 2019-12-20 |
| 发明（设计）人： | 方锐;赵馨;陈道贞;蔡立義;肖建平 | 申请（专利权）人： | 无锡市妇幼保健院 |
| 主分类号： | C07K19/00 | 分类号： | C07K19/00;C12N9/22;C12N15/85 |
| 代理公司： | 11002 北京路浩知识产权代理有限公司 | 代理人： | 王文君 |
| 地址： | 214002 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种高效定点转基因的工具。所述工具包含或可产生gRNA‑不具备内切酶活性的Cas9蛋白‑PB转座酶复合物，所述gRNA靶向基因组特定位点；所述不具备内切酶活性的Cas9蛋白为第十位氨基酸残基D突变为A、第840位氨基酸残基H突变为A的双突变Cas9蛋白。本发明通过设计靶向动物基因组的导向RNA(gRNA)，在gRNA与定点转座酶共表达情况下，PB转座酶随着CRISPR/cas9和gRNA的复合物靶向到基因组的特异位置，PB转座酶在特异的位点实现转座功能，如此同时共转染供体质粒(包含有外源目标基因的载体)，即可将外源的目标载体转座到基因组中特异性位点，从而实现定点转基因。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 高效 定点 转基因 工具 及其 应用 | ||
【主权项】：
1.一种高效定点转基因的载体，其特征在于，所述载体包含：/n1)可转录tracrRNA和crRNA的核苷酸序列；/n2)编码双突变Cas9蛋白的核苷酸序列；所述双突变Cas9蛋白为第十位氨基酸残基D突变为A、第840位氨基酸残基H突变为A的Cas9蛋白；/n3)编码PB转座酶的核苷酸序列；/n所述载体的表达产物中，tracrRNA与crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体gRNA，双突变Cas9蛋白与PB转座酶之间通过6个串联重复的GGS肽链连接，gRNA引导双突变Cas9蛋白与PB转座酶靶向作用于基因组特定位点；/n所述tracrRNA与crRNA在U6和H1启动子的驱动下转录；/n所述载体从5’到3’端依次为U6启动子驱动crRNA表达框，CMV启动子驱动Cas9蛋白-PB转座酶融合蛋白表达框，H1启动子驱动tracrRNA框。/n
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