[发明专利]一种检测黄曲霉毒素M1的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测黄曲霉毒素M1的方法及试剂盒。将黄曲霉毒素M1核酸适体(Apt)与单链信号探针DNA(ssDNA)杂交，形成杂交链Apt‑ssCNA；将杂交链Apt‑ssCNA置于待测样品中，当其中有AFM1存在时，杂交链Apt‑ssCNA中Apt段与AFM1反应生成Apt‑AFM1复合物，并释放出单链信号探针ssDNA；杂交链Apt‑ssCNA经DNA扩增生成双链DNA，在核酸外切酶选择性地催化作用下双链DNA快速水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA不水解而被保留下来；在ssDNA诱导下，银离子还原生成近红外荧光银纳米簇；检测体系荧光强度，依据荧光强度与AFM1量的关系，测定待测样品中AFM1的含量。该方法灵敏度高、操作简单、低成本。

主权项

一种检测黄曲霉毒素M1的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)先分别将含黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的Tris缓冲溶液和含单链信号探针ssDNA的Tris缓冲溶液置于90℃水浴中加热5分钟后，迅速置于冰浴中保持5分钟；分别取上述处理过的3.0μmol黄曲霉毒素M1核酸适体Apt溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA溶液40μL混合，在37℃反应1h，形成杂交链Apt‑ssDNA；(2)向该杂交链Apt‑ssDNA体系中加入待测样品，当待测样品中有黄曲霉毒素M1即AFM1时，Apt‑ssDNA中的Apt选择性地与AFM1反应生成Apt‑AFM1，同时释放出单链信号探针ssDNA；(3)剩余Apt‑ssDNA的去除：向步骤(2)体系中依次加入10μL扩增缓冲溶液、18μL dNTP(10mM)和2μL Phi29 DNA聚合酶(10u/μl)，在37℃下反应8分钟；体系中剩余的Apt‑ssDNA经DNA扩增形成双链DNA；接着再向该反应体系中加入2μL Exo III核酸外切酶(20u/μL)和10μL NH₄F(25mM)‑NaCl(0.1M)溶液，双链DNA在核酸外切酶选择性地催化作用下迅速水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA被保留下来，从而消除剩余杂交链Apt‑ssDNA的干扰；其中，所述扩增缓冲溶液组成为50mM Tris‑HCl，10mM MgCl₂，10mM(NH₄)₂SO₄，pH 7.5；(4)利用Apt‑AFM1不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能够诱导银离子还原生成强荧光的近红外银纳米簇的原理，检测银离子还原检测体系近红外荧光的强度，依据荧光强度与AFM1的量的关系，测定待测样品中的黄曲霉毒素M1即AFM1的含量；其中，所述银离子还原检测体系包括先后添加的150μL柠檬酸钠溶液(10mM，pH 8)、10μL银离子溶液(2.5mmol)和使银离子迅速还原成近红外荧光银纳米簇的120μL+4价硫无机化合物还原剂(1mM、pH 8)。