[发明专利]一种提取2′，3′-环形核苷单磷酸的方法

摘要

本发明涉及一种提取2′,3′‑环形核苷单磷酸的方法，包括如下步骤：(1)提取基因组DNA，PCR扩增，制得基因if3；(2)将基因if3与表达质粒连接，转化后，经发酵培养，制得重组菌发酵液；(3)分离重组菌发酵液中的菌体，破碎细胞，镍柱亲和层析提纯，静置，固液分离，取上清液；(4)将上清液经超滤去除蛋白杂质，经C₁₈反向色谱柱进行高效液相分离，分别制得含四种2′,3′‑环形核苷单磷酸溶液。本发明提供的方法首次实现了从大肠杆菌中同时直接提取四种2′,3′‑环形核苷单磷酸。通过微生物生物发酵，从头合成四种2′,3′‑环形核苷单磷酸，不需要特定的前体物，无化学合成法的污染，简单方便，每升培养液可提取5mg的四种纯品2′,3′‑环形核苷单磷酸。

主权项

1.一种提取2', 3'‑环形核苷单磷酸的方法，包括如下步骤：（1）提取大肠埃希氏菌（Escherichia coli）K12菌株的基因组DNA，利用PCR扩增编码IF3蛋白的基因if3，制得基因if3；所述PCR特异引物序列如下：F: GGAATTCCATATGATTAAAGGCGGAAAACG，R: CCGCTCGAGCTGTTTCTTCTTAGG；（2）将步骤（1）制得的基因if3酶切后与同样经酶切的表达质粒PET‑22b连接，然后转化到E.coli BL21（DE3）菌株中，进行发酵培养，制得重组菌发酵液；（3）分离步骤（2）制得的重组菌发酵液中的菌体，破碎细胞，镍柱亲和层析提纯重组蛋白IF3，然后0℃静置2.5～3.5 d，固液分离，取上清液；（4）将步骤（3）制得的上清液经超滤去除蛋白杂质，滤液经C18反向色谱柱进行高效液相分离，分别制得含四种2', 3'‑环形核苷单磷酸溶液。