[发明专利]一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法

摘要

本发明公开一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，依次包括乌桕茎尖剥取、预培养、装载、玻璃化处理、小液滴制作、超低温冷冻保存、卸载和恢复培养的步骤。本发明具有长期安全、稳定可靠、简单有效的保存乌桕优良种质资源的方法，超低温保存后乌桕茎尖成活率高达40％，茎尖再生率为37.8％的优点。

主权项

一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于，依次包括：乌桕茎尖剥取、预培养、装载、玻璃化处理、小液滴制作、超低温冷冻保存、卸载和恢复培养的步骤；所述的预培养是指：将剥取的茎尖接种于添加有0.2‑0.5M蔗糖的MS固体培养上，于25±2℃的恒温培养室黑暗培养1‑5d；所述的装载具体是指：将预培养后的离体茎尖转接于装载液中，于室温下装载处理10‑60min；所述的装载液的组成为：MS+2M甘油+0.4M蔗糖；所述的玻璃化处理具体是指：将装载处理后的茎尖转接于PVS2溶液中，于0℃处理1‑4h；所述的PVS2溶液的组成为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4M蔗糖；所述的卸载是指：将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于卸载液中进行解冻和洗涤；所述的卸载液的组分为：MS+1.2M蔗糖；所述的卸载和洗涤条件为：室温下洗涤茎尖2‑3次，每次洗涤时间5‑10min；所述的恢复培养具体是指：将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表面残留液，转接于恢复培养基中进行恢复培养；所述的恢复培养基为MS+0.5‑2.0mg/L6‑BA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8；所述的恢复培养条件为：25±2℃的恒温培养室黑暗培养7d,最后转至光照强度为40μmolm‑2s‑2,光照时间为14h的条件下进行植株再生。