[发明专利]一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法

摘要

本发明适用于山核桃无性栽培的技术领域，公开了一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，包括如下步骤：仪器准备、植物材料准备、总RNA提取并检测、Aux/IAA基因的RACE扩增、CcIAA基因验证和分析、CcIAA基因生物信息学的分析、CcIAA基因在转录水平上的分析和CcIAA基因在翻译水平上的表达分析来分析。本发明以山核桃嫁接苗作为分析材料，提取RNA并反转录成cDNA，最终克隆得到山核桃生长素原初响应基因CcIAA，然后利用qRT-PCR以及Western blot技术来了解该基因在山核桃嫁接过程中转录和翻译水平的表达情况，通过对生长素原初响应基因CcIAA的克隆和功能分析，有利于更进一步了解Aux/IAA对山核桃的嫁接成活率影响作用机制以及山核桃嫁接过程中生长素的信号转导机制，提高山核桃嫁接的成活率。

主权项

一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一、仪器准备：液氮罐、高速冷冻离心机、灭菌锅、超级纯水仪、电热恒温水箱、超级低温冰箱、紫外分光光度计、PCR仪、通风橱、电泳槽、小型涡旋仪、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、制冰机、超净工作台、转膜仪、烧杯、天平、移液管、研钵研棒和荧光实时定量PCR仪；步骤二、植物材料准备：用于山核桃Aux/IAA基因克隆的实验样品，选取山核桃的嫁接枝条进行采集，采取后迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，用作样品并存放入‑70℃环境中备用；用于qRT‑PCR和Western blot的样品，选取长势相似的两年生的实生苗砧木和留有一个健壮芽的大概约9cm左右长的一年生苗的接穗，并在实验基地中完成嫁接，采用两种不同的生长激素：IAA 4mg/l，NPA 0.3ug/l来处理山核桃接穗，时间为30min，砧木用蘸有激素的毛笔蘸湿。对照组用清水处理。在山核桃嫁接之后0天，1天，3天，5天，7天，14天采样，共有36个不同的样品，我们对每一个样品准备25个重复并用锡箔纸包好后立即放入液氮中，并存放于‑70℃保存后备用。样品编号如下：对照组接穗：j0，j1，j3，j5，j7，j14；对照组砧木：z0，z1，z3，z5，z7，z14；IAA处理接穗：Ij0，Ij1，Ij3，Ij5，Ij7，Ij14；IAA处理砧木：Iz0，Iz1，Iz3，Iz5，Iz7，Iz1；NPA处理接穗：Nj0，Nj1，Nj3，Nj5，Nj7，Nj14；NPA处理砧木：Nz0，Nz1，Nz3，Nz5，Nz7，Nz14；步骤三、总RNA提取并检测：在实验室中，对经步骤二采集后的嫁接枝条样品进行总RNA的提取，获得嫁接枝条样品的总RNA提取液，并从总RNA的提取液中吸取2ul进行OD值测定，检测质量与浓度，从总RNA的提取液中吸取4ul与Buffer混匀后进行电泳检测；步骤四、Aux/IAA基因的RACE扩增：步骤如下：1)RACE引物设计：利用山核桃454测序数据库，找到一个320bp的生长素IAA基因，运用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，引物如下：GSP1：GTTCTTCTCTGTCATCTGTCCCCCGGSP2：TCAGAGAGGGAAGGCTACAAGGGGTIAA‑F：ATGGAAAGCAAGGTAGCATATGIAA‑R：TCATACTCCACATCCCAAGCCTC2)扩增第一链cDNA：操作步骤如下：①在两个200ul离心管中分别加入2.0ul 5×First‑Stand Buffer，1.0ul DTT，1.0ul dNTP Mix混匀，轻微离心至底部，待用；②在另两个200ul的离心管中加入2ul总RNA，在合成5’‑RACE‑Ready cDNA的离心管中加入1ul 5’‑CDS Primer和0.75ul双蒸水；在合成3’‑RACE‑Ready cDNA的离心管中加入1ul 3’‑CDS Primer和1.75ul双蒸水，混合均匀，轻微离心至管底；③对步骤②中的混合液72℃温育3min，42℃2min，瞬时离心；④在合成5’‑RACE‑Ready cDNA的离心管中再加入1ul SMART Ⅱ A Oligo，混匀；⑤在步骤①中的混合液中加入0.25ul RNase Inhibitor和1.0ul SMARTScribe Reverse Transcriptase，混匀，PCR反应：42℃90min；72℃10min；⑥加入100ul双蒸水稀释，保存在‑20℃冰箱备用。3)RACE扩增；以获得的5’‑RACE‑Ready cDNA和3’‑RACE‑Ready cDNA为模板分别进行5’和3’RACE‑PCR反应，扩增5’和3’cDNA末端。RACE反应体系为50ul，内含10×UPM 5ul、基因特异性引物1ul、PrimeSTAR Max DNA聚合酶25ul、双蒸水16.5ul、模板2.5ul。RACE扩增的条件为：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃90s，共30个循环；最后72℃延伸5min。4)阳性片段回收；对经过步骤3)所获得的5’和3’cDNA末端扩增产物割胶回收，操作步骤如下：①利用1％琼脂糖凝胶电泳跑完胶，再用干净的手术刀把含有目的片段的胶块切割下来，最后放入已经编好号的1.5ml离心管中；②依据胶块重量加入3倍体积的Buffer B2；③在37℃水浴锅中水浴10min直至被完全融化；④把融化完全的溶液移入吸附柱，12000rpm，离心1min，然后去除收集管里面的液体，再将吸附柱继续放进同样的收集管中；⑤参照第④步重复一遍；⑥往吸附柱里面加入700ul的Wash solution，12000rpm，离心1min，然后去除收集管里面的液体，再将吸附柱重新放到收集管里面；⑦参照第⑥步重复一遍；⑧将空吸附柱和收集管放入离心机，12000rpm，离心1min；⑨往吸附膜中央加入30ul Elution buffer，室温静置1min，将吸附管与新的离心管放入离心机中，12000rpm，离心1min；⑩将DNA溶液放在‑20℃下保存。5)PCR回收产物和PMD18‑T载体连接：在PCR回收产物与载体连接前必须添加PolyA尾巴，以获得的回收产物DNA为模板，加PolyA尾反应体系为10ul：内含10×Buffer 2.5ul，dNTP 2ul，Mg²⁺1.5ul，rTaq酶0.2ul，双蒸水0.8ul，模板3ul；PCR反应条件为：72℃延伸20min。外源DNA和质粒载体的连接反应，在200ul PCR管中反应，操作步骤如下：①配制DNA溶液5ul：1.0ul的Pmd 18‑T vector、0.1mol～0.3mol(4ul)的目的DNA；②加入5ul的Solution Ⅰ，在16℃下连接过夜(10小时以上)。6)制备感受态并转化：感受态的制备步骤如下：①受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3～5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜(12h左右)；将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250ul菌液转接到25ml LB液体的培养基里面，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右；②感受态的细胞制备：在超净工作台上，将细菌液体转入50ml离心管中，然后冰上放置10min；在4℃下，4000r/min，离心10min，弃去上清并将管倒置1min以便培养液流尽；用在冰上已经预冷的0.1mol/l的CaCl₂溶液10ml轻轻重悬细胞，然后冰上放置30min；0～4℃4000r/min，离心10min，然后弃去上清并且加入2ml预冷的0.1mol/l的CaCl2溶液，再轻轻重悬细胞，必须冰上放置；③感受态的细胞分装与冻存：在2ml已经制备完全的感受态的细胞里面加入2ml30％甘油(即1:1体积，甘油终浓度15％)；将此感受态细胞分装成每份200μL(1.5ml dorf管)，液氮速冻，快速转入‑70℃冰箱保存。将连接过夜的产物转化，操作步骤如下：①将感受态的细胞在冰上溶化并且加入需要转化的10ul连接产物，冰上放置30min；②42℃水浴锅中热击45s，冰上放置2min；③加入750ul LB(不含Amp)培养基，200rpm 37℃恒温摇床来培养1h左右；④4000rpm离心5min，留100ul涂板(含Amp)；⑤37℃倒置培养12‑16小时左右。7)细菌检测：操作步骤如下：①1.5ml离心管加入1ml LB(含Amp)培养基；②挑取单菌落(>3个)；③200rpm、37℃恒温摇床来培养5h左右；④验证：以菌液为模板，菌检反应体系为25ul：内含内含10×Buffer 2.5ul、dNTP 2ul、Mg²⁺1.5ul、rTaq酶0.2ul、上下游引物各2.5ul、双蒸水10.8ul、模板3ul。菌检反应条件为：94℃3min；94℃30s，63℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。⑤1％琼脂糖的凝胶电泳检测；⑥重摇含有目的基因的菌液，测序，然后由5’和3’cDNA末端序列拼接得到全长cDNA序列。步骤五、CcIAA基因验证和分析：根据全长序列设计的引物，进行验证。用5’‑RACE‑Ready cDNA为模板进行PCR，反应体系为50ul，内含上下游引物各3ul、PrimeSTAR Max DNA聚合酶25ul、双蒸水16ul、模板3ul。PCR扩增条件为：94℃1min；94℃30s，67℃30s，72℃1min 30s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增后的产物割胶回收，并加PolyA尾后利用pMD‑18T载体连接并测序，得到全长序列。测定得到的序列利用NCBI，DNAMAN软件搜索并对同源性进行比对以及推导氨基酸的序列；步骤六、CcIAA基因生物信息学的分析：利用在线软件分析CcIAA蛋白质理化性质；Clustalx软件来进行序列的比对；DNAMAN软件对蛋白序列进行比对；DNAMAN软件来构建系统的进化树并进行分析；步骤七、CcIAA基因在转录水平上的分析：步骤如下：1)提取山核桃不同嫁接时期嫁接茎的总RNA；2)对内参与目的基因进行引物设计：根据CcIAA的cDNA序列，运用Primer premier 5.0软件设计基因引物三对：Aux/IAA‑f‑1：5’‑ATGGAGATTGGATGCTGGTTGGAux/IAA‑r‑1：5’‑TGGGTTGCTGTGACTTGTAGGTAux/IAA‑f‑2：5’‑CTGGTTGGAGATGTTCCGTGGGAAux/IAA‑r‑2：5’‑CTGGGTTGCTGTGAGTTGTAGGTAux/IAA‑f‑3：5’‑CAGGCTGAGGCTGCTGGTATTTAAux/IAA‑r‑3：5’‑ATTCCGACCCCTTGTAGCCTTCCPrimer premier 5.0软件设计引物：a‑F(Cc‑actin内参引物)5’‑GCTGAACGGGAAATTGTCa‑R(Cc‑actin内参引物)5’‑AGAGATGGCTGGAAGAGG3)合成cDNA第一链：反转录反应体系为10ul体系，所述的反应体系如下：在200ul反应管中加入模板RNA 1.0ul，OligdT 1.0ul，双蒸水6.0ul，反应条件为70℃5min，冰浴10min；然后在该反应管中加入5×Reverse Transcription M‑MLV Buffer 2.0ul，dNTP 0.5ul，RNA酶抑制剂0.25ul和逆转录酶(M‑MLV)0.25ul，反应条件为42℃60min，70℃15min；4)验证模版与引物：以反转录好的cDNA为模板，挑选一对合适的目的基因引物进行荧光定量RT‑PCR。反应体系为25ul体系：内含上下游引物各2.5ul，10×Buffer 2.5ul，dNTP 2ul，Mg²⁺1.5ul，rTaq酶0.2ul，双蒸水10.8ul，反转录好的cDNA模板3ul。PCR扩增反应条件：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环；然后72℃延伸5min，1％琼脂糖凝胶电泳检测；5)实时荧光定量PCR：采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒，编号TaKaRa Code：DRR041A。以反转录好的cDNA为模板，反应体系为10ul体系：内含上下游引物各0.2ul，SYBR Premix Ex TaqTM(5×)5ul，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.2ul，双蒸水3.4ul，反转录cDNA模板1ul。荧光定量PCR反应条件：95℃30s；95℃15s，60℃15s，共40个循环，在Bio‑RAD荧光定量PCR仪上进行。步骤八、CcIAA基因在翻译水平上的表达分析：对不同时期山核桃嫁接茎上的总蛋白进行提取并检测，然后通过Western blot技术了解CcIAA基因在山核桃嫁接过程中的翻译水平表达情况。