[发明专利]一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法及应用

摘要

本发明公开了一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法及应用，包括：孢子悬液的制备；荷叶总生物碱的制备；荷叶总生物碱抑菌效果的测定；荷叶总生物碱最低杀菌浓度的测定；荷叶总生物碱最低抑菌浓度的测定。本发明首次明确荷叶总生物碱对植物病原真菌具有明显的抑制活性。尤其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性最强，最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为160μg/mL；由于我国荷叶资源丰富,从荷叶中提取生物碱类活性物质，成本低廉、无毒无害；荷叶总生物碱用于防治植物病害，可作为一种潜在的生物农药，具有广阔的开发应用前景。

主权项

一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法，其特征在于，所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法包括：孢子悬液的制备：将保存菌种接入马铃薯固体培养基的试管斜面活化，取一支生长4d的试管斜面，用50mL的0.9％的无菌生理盐水倒入试管中，用无菌的玻棒在斜面上搅动，将孢子刮下来，并用两层纱布过滤，装入三角瓶中，用血球板计数法和平皿计数法测定其生长浊度，将孢子悬液稀释；经微波辅助热回流法提取、D－101型大孔吸附树脂纯化、冷冻干燥得到，其中荷叶碱含量为1.37％，取荷叶总生物碱固体适量，溶解，配置总生物碱溶液，调节pH，将溶液用微量小滤器过滤除菌后用于体外抑菌试验；采用管碟法，待培养基冷却到50℃时，加入2mL孢子悬液，摇匀，倒入直径为12cm培养皿中，待凝固后，将牛津杯放置平皿菌层上，每杯加入荷叶总生物碱，观察抑菌圈的大小；采用试管倍比稀释法，分别用50％乙醇溶液置备荷叶总生物碱，分别吸取以上浓度的荷叶总生物碱1mL加入到19mL液体培养基中，再加入0.2mL孢子悬液，30℃培养48h，从试管中吸取0.2mL的培养液，加入固体培养基中，涂布均匀，倒置放入30℃的恒温培养箱中，培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱最低杀菌浓度；采用平皿倍比稀释法，培养皿中加入19.0mL培养基，待培养基还未凝固时，分别在各个培养皿中加入浓度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.312mg/mL、0.16mg/mL荷叶总生物碱溶液1.0mL，摇匀，同时以50％乙醇为对照，待培养凝固后，向各平皿中加入0.2mL孢子悬液，涂布均匀，30℃倒置培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱的最低抑菌浓度。