[发明专利]单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒

摘要

本发明实施例公开了一种单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒，其包括在所述单个PCR反应管中混合样本核酸，Tth DNA聚合酶，H-Taq DNA聚合酶，Mn(OAc)₂，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探针，以及内标上下游引物和探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的检测波长不同；所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述HIV的上下游引物。本发明的能够检测HIV、HCV、HBV三种常见血液传染病毒的各种基因型别，同时降低成本，提高仪器使用率，满足血液中心检测要求。

主权项

单管中多重靶核酸的实时荧光检测PCR方法，每种病毒靶核酸分别是HBV‑DNA，HCV‑RNA和HIV‑1‑RNA，其特征在于，包括如下步骤：(1)在所述单个PCR反应管中混合样本核酸，Tth DNA聚合酶，H‑Taq DNA聚合酶，Mn(OAc)₂，dNTPs，内标，HBV‑DNA、HCV‑RNA以及HIV‑1‑RNA的上下游引物和探针，以及内标上下游引物和探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的检测波长不同；其中，所述HBV‑DNA上游引物的碱基序列为：SEQ ID NO:15’‑TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC‑3’；所述HBV‑DNA下游引物的碱基序列为：SEQ ID NO:25’‑AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA‑3’；所述HBV‑DNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:35’‑TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA‑3’；所述HCV‑RNA上游引物的碱基序列为：SEQ ID NO:45’‑AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG‑3’；所述HCV‑RNA下游引物的碱基序列为：SEQ ID NO:55’‑GGTGTACTCACCGGTTCCG‑3’；所述HCV‑RNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:65’‑CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT‑3’；所述HIV‑1‑RNA上游引物的碱基序列为：SEQ ID NO:75’‑CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG‑3’；所述HIV‑1‑RNA下游引物的碱基序列为：SEQ ID NO:85’‑CCAGAGAGCTCCCAGGCTC‑3’；所述HIV‑1‑RNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:95’‑TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT‑3’；所述内标探针的碱基序列为：SEQ ID NO:105’‑AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG‑3’；所述内标的扩增子序列的碱基序列为：SEQ ID NO:115’‑CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCCAAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG‑3’；(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；(3)选择FAM通道检测HIV‑1RNA，ROX通道检测HCV‑RNA，CY5通道检测HBV‑DNA；根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有HBV‑DNA，HCV‑RNA和HIV‑1‑RNA中的一种或几种病毒靶核酸存在于样品。