[发明专利]一种野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法

摘要

一种野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法，步骤有：取继代培养无菌组培苗，留基部放入不含激素MS培养基内培养，切离基部新萌植株，转入含0.3molL‑1蔗糖和脱落酸0.5‑5mgL‑1培养基上培养，再转入0.7molL‑1和含脱落酸0.5‑5mgL‑1培养基上预培养，剥取茎尖，在0.4 molL‑1蔗糖和甘油2moL‑1MS固体培养基预培养，在2‑4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，放在装载条上，再浸入含有0.1‑0.3%氯化钙、0.4 molL‑1蔗糖和2moL‑1甘油MS液体培养基中，经固定后，吸去多余液体，置于预处理溶液中处理，再转入玻璃化保护剂PVS2中进行冰浴处理，然后投入液氮中保存。其有益效果是，保存方法简便易行，稳定可靠，保存后野生稻恢复生长状况良好。 1

主权项

1.一种野生稻茎尖的超低温保存方法，其特征在于，所述保存方法包括如下步骤：

步骤a:取继代培养3个月以上的无菌组培苗，剪去上部植株，留基部放入不含激素的MS培养基内进行培养，所述步骤a中的继代3个月以上无菌组培苗，剪去上部植株，留基部约3cm，根部约1cm放入不含激素的MS 培养基；

步骤b:通过步骤a培养5‑7天后，将基部新萌植株切离后，带基部转入含0.3mol·L^‑1的蔗糖和脱落酸0.5‑5mg·L^‑1的培养基上培养，所述步骤b中的基部新萌芽的长度为0.5‑1cm；

步骤c:经过步骤b培养7‑10天后的植株，再转入0.7mol·L^‑1蔗糖和含脱落酸0.5‑5mg·L^‑1的培养基上预培养3‑7天；

步骤d:经过步骤c预培养3‑7天后的植株在解剖镜下剥取2‑3mm的茎尖，在含有0.4 mol·L^‑1蔗糖及甘油2mol·L^‑1的MS固体培养基上预培养16小时，所述MS固体培养基中不含NH₄⁺；

步骤e:用镊子将经过步骤d预培养后的茎尖在2‑4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，然后整齐放在5mm×20mm金属网状装载条上，每条装载条上5‑10个茎尖；

步骤f:将带茎尖的装载条浸入含有0.1‑0.3%氯化钙、0.4 mol·L^‑1蔗糖和2mol·L^‑1甘油的MS液体培养基中，经10‑30min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体，所述MS液体培养基中不含NH₄⁺，

步骤g:将固定好的带茎尖的装载条放于预处理溶液中在室温下处理20‑60min后，转入玻璃化保护剂PVS2中进行2‑5小时的冰浴处理，将带茎尖的装载条迅速投入液氮中保存，其中，所述预处理溶液含有0.4 mol·L^‑1蔗糖及甘油2mol·L^‑1，不含NH₄⁺的MS液体培养基，所述玻璃化保护剂PVS2不含NH₄⁺。

2.一种野生稻超低温保存后的恢复培养方法，其特征在于，所述野生稻经过超低温保存方法保存过，解冻时从液氮中取出带茎尖的装载条，立即放入1.2mol·L^‑1的1/2MS液体培养基中快速解冻2min，并在培养基中洗涤20min，所述1.2mol·L^‑1的1/2MS液体培养基不含NH₄⁺，将带茎尖的装载条在滤纸上吸干后置于不含激素的1/2MS培养基中暗培养1天，然后在解剖镜下将茎尖逐一由装载条剥离，转移到含BA及NAA的培养基上进行暗培养，所述含BA及NAA的培养基不含NH₄⁺，经过处理过的茎尖再生后转入含BA及NAA的培养基光照培养，所述茎尖再生后转入含BA及NAA的培养基含NH₄⁺。