[发明专利]一种人工湿地堵塞缓解细菌的筛选方法及应用

摘要

本发明公开了一种人工湿地堵塞缓解细菌的筛选方法及应用，步骤是：A、细菌富集：取湿地堵塞物进行细菌富集；B、细菌初筛：在加粗滤纸培养基培养富集后的细菌，产纤维素降解酶的细菌可在滤纸上形成斑点，取之纯培养；C、细菌复筛：取纯培养后的菌株接种于血琼脂培养基，取产生溶血圈的菌落；D、细菌优选：表面活性剂可在油膜上形成排油圈，排油圈最大的细菌为最优细菌；E、筛选菌产物鉴定。F、一种人工湿地堵塞缓解细菌的筛选应用：筛选出产生产量较大的生物表面活性剂的菌种；筛选的细菌产生生物表面活性剂缓解人工湿地堵塞，筛选菌源为人工湿地细菌，产生的表面活性剂高效、易生物降解，能安全地缓解人工湿地堵塞。

主权项

一种人工湿地堵塞缓解细菌的筛选方法，其步骤是：A、细菌富集：在建成运行的人工湿地中收集堵塞物，取2g堵塞物，加入100ml无菌水，在摇床上振荡3.5－4.5h，取上清液10ml接种到装有90ml富集培养基中，于28－32℃、120r/min培养2－4d，再取培养液转接到富集培养基中，重复培养1－3次得培养液；B、细菌初筛：（1）在初筛培养基中加上一张灭菌并均匀浸有液体石蜡的粗纤维滤纸，倒平板时置于培养基内部表层，取富集培养液稀释，涂布于富集培养基上，于28－32℃培养5‑7d，挑选滤纸上产生斑点处的菌株纯化，得到有产表面活性剂性能降解纤维的细菌；（2）取滤纸斑点上生长的菌株在LB培养基上划线纯培养；C、细菌复筛：取纯培养后的菌株接种于血琼脂培养基上，于27.3－29.3℃培养2－3d，挑选产生透明溶血圈的菌落，获得细菌产表面活性剂；D、细菌优选：再按步骤（A）进行细菌富集发酵得到纯培养液，取培养皿加入80ml蒸馏水后，加入100μL正己烷使之在水表面形成油膜，取10μL培养液加到油膜中央，油膜会从中央扩散形成排油圈，排油圈直径与生物表面活性剂的浓度呈正比，测得排油圈大的纯培养菌株；E、筛选菌产物鉴定：取筛选出的培养液30ml，1200r/min离心18‑22min去除菌体，共离心2‑4次；上清液用浓盐酸调节至pH=1.8－2.2，出现絮状沉淀，4℃静置过夜，1200r/min离心14－16min收集沉淀，用pH=1.8－2.2的酸水洗1－2次，分离沉淀，使用1M氢氧化钠溶液溶解至中性，用二氯甲烷抽提，取有机相，挥发后冷冻干燥得到生物表面活性剂，该生物表面活性剂为糖脂或脂肽，将样品溶于二氯甲烷配成溶液进行薄层层析，展开剂为正丁醇/乙酸/水（体积比为16/4/8），显色剂为：苯酚‑硫酸试剂：3g苯酚和5mL浓硫酸溶于95mL乙醇中，糖脂显棕色斑点，茚三酮显色剂：0.5%（质量体积比）茚三酮无水丙酮溶液，脂肽显红色；所述的富集培养基组成为：六水合硝酸氨1g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，七水合硫酸镁0.2g，二水合氯化钙0.02g，七水合硫酸亚铁2.5×10^‑5g，5ml液体石蜡，1000mlH₂O，pH=7.0，其中液体石蜡刺激微生物产生表面活性剂；所述的初筛培养基组成为：富集培养基去掉液体石蜡，加上2%体积比琼脂倒成的固体平板；所述的LB培养基组成为：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，pH=7.0；所述的血琼脂培养基组成为：牛肉膏蛋白胨培养基，pH=7.4－7.6，冷却至48－52℃按10%加入兔血，摇匀倒平板。